1、中国协和医科大学八年制临床医学生药理学实验,实验四 放射配体-受体结合实验,中国协和医科大学药理学系 叶菜英,实验目的,观察了解受体与配基的结合方式、原理。,掌握受体与配基结合饱和曲线、解离常数及受体含量的测定与计算方法。,实验原理1,本实验用氚标记的依托啡（Etorphine）研究阿片受体及其配基的结合情况，计算出受体含量及解离常数，分析有多种不同亲和力的受体存在时配基与受体相互作用规律。,实验原理2,放射配基与受体制备物作用时，有配基与受体的特异性结合和配基与非受体分子的非特异性结合。特异性结合亲和力高且有饱和性，非特异性结合不易饱和。为得出特异性结合量，必须设法在总结合量中减去非特异结合
2、量。,实验原理3,总结合管中包含有特异结合与非特异结合量，同时制备的非特异结合管中需加入大量（远远大于标记的放射性配基）非标记特异性配基以使受体几乎全部被非标记配基饱和，标记配基只能与非特异性位点结合，从而得到总结合量和非标记结合量。,实验原理4,由此我们可以得到总结合量和非特异性结合量的计数，然后用总结合管计数减掉非特异结合管的计数即可得到特异性结合量，根据clark受体理论，作Scatchard图，即可求出最大结合量Bmax及解离常数 KD。,材料方法,*材料： 1、3H-依托啡，25M水溶液，按1：0.7的比例依次稀释，配制成6个浓度. 2、制备提取吗啡受体粗膜（P2膜） 3、甲苯闪烁液
3、30005000ml 4、50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5,*方法,1. P2膜的制备：取大鼠全脑，弃去小脑及表面脑膜血管后称重，加10倍（重量/体积）Tris缓冲液后用组织粉碎机研碎（注意冰浴）制成10匀浆，41000g离心10分钟后取上清，416000g离心20分钟后保留沉淀，加Tris缓冲液混悬均匀，30 保温30min后再次416000g离心20分钟，保留沉淀并用Tris缓冲液混悬，测定蛋白浓度后置-20 保存备用，使用时解冻后稀释，使其蛋白浓度为1.67mg/ml。,2.加样,每个测定点双复管依下表顺序加样，P2膜最后加 Tris-HCl 依托啡 3H-依托啡 P2膜 总
4、结合 0.2ml / 0.1ml 0.6ml 非特异结合 / 0.2ml 0.1ml 0.6ml 加样后的样品试管30 保温30min，之后冰浴终止反应，细胞收集器过滤，3ml冷Tris-HCl洗涤两次后取下滤膜放入闪烁杯，加5ml闪烁液、3ml无水乙醇进行液闪测定。,结果处理,以配基浓度F为横坐标，与受体结合的配基量B为纵坐标，做饱和曲线。 以B/F为纵坐标，B为横坐标绘制Scatchard图，计算出Bmax及KD值,计算及绘图 测定结果为放射计数，需转换成配基浓度；特异性结合为 总结合管减去非特异 性结合管。,注意事项,注意反应温度及时间，一般来讲温度高反应时间要短些，温度低反应时间则适当延长。,此实验为放射性同位素实验，注意同位素污染及防护。,此实验为微量实验，注意加样器的正确使用,注意实验条件，此实验（除30 保温过程外）需在冰浴中进行。,实验讨论：,本实验的意义，掌握受体结合相关概念及原理。针对本组实验结果进行分析讨论讨论成功或失败原因。,参考资料,药理实验讲义 中国协和医科大学药理室 2005年10月药理学 杨世杰 主编 人民卫生出版 社 2005年8月现代医学实验技巧张德昌主编 协和医科大学出版社 1995年医学药理学张德昌主编 协和医科大学出版社 1998年,Thanks!,
