1、重组蛋白药物纯化与质量控制,医药生物技术中试实验邬婧2017.5.3,,LOGO,Contents,,LOGO,生化分离技术,基因重组技术,免疫检测技术,给人类带来了抗体和药物。,现代生物技术,蛋白纯化原则,,LOGO,蛋白纯化原则,,LOGO,蛋白纯化原则Guidelines for Protein Purification,确定目标purity, quantity, biological activity, economy充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法fast detect
2、ion of protein activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically,,LOGO,动物,植物,培养物,纯化流程,,LOGO,纯化流程,,LOGO,浓缩保存状态保存条件保存期限,纯化流程,,LOGO,纯化流程,,LOGO,Capture,Resolution,Speed,Recovery,Capacity,Initial purification of the target molecule fro
3、m crude or clarified source material Concentration and stabilization (e.g. removal of proteases),,LOGO,Intermediate Purification,Resolution,Speed,Recovery,Capacity,Removal of bulk impurities,,LOGO,Polishing,Resolution,Speed,Recovery,Capacity,Final removal of trace contaminants, e.g. structural varia
4、nts of the target protein,,LOGO,一般生产纯化不超过4个步骤。,纯化流程,,LOGO,分离纯化机制,带电基团,不同的大小和尺寸,疏水基团,相互作用,极性不同,,LOGO,分离纯化机制,不同层析介质的成本：离子交换，金属螯合，疏水层析，分子筛，亲和层析,,LOGO,稳定性（PH值，活性）等电点疏水性分子大小，形状。关键辅助因子,关键杂质产品浓度引进污染物产品纯度单位成本产量,检测方法-质量控制,纯化方法,纯化总结,,LOGO,纯化总结,,LOGO,Develop assay methodsSet the aims Characterize the target pr
5、oteinUse different separation principlesUse few stepsLimit sample handling between purification stepsRemove proteases quicklyReduce volume in early stepTRY!,纯化总结,,LOGO,19,重组蛋白药物的质量控制,,LOGO,20,常规质量控制方法,,LOGO,21,聚丙烯酰胺凝胶(PAG),单体：丙烯酰胺(Acr)交联剂：甲叉双丙烯酰胺(Bis)聚合剂：过硫酸铵（APS）催化剂：四甲基乙二胺(TEMED）产物：三维网状结构的凝胶.,电泳(E)
6、,带电颗粒（蛋白质）在电场作用下，在PAG上向着与其电荷相反的电极移动，从而达到分离的效果。,SDS-PAGE,,LOGO,22,蛋白质在PAGE中的分离因素,电荷因素分子大小分子形状,SDS-PAGE,23,灵敏度1mg,(1) 纯度分析(2) 分子量的测定(3) 初步鉴定(4) 含量的测定 (配合扫描半定量)(5) 水解的分析 (如酶谱法)(6) Western Blotting的前部分(7) 氨基酸序列分析-结合质谱,SDS-PAGE,,LOGO,SDS-PAGE,,LOGO,电泳出现两条或者两条以上条带免疫印迹,SDS-PAGE,,LOGO,将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反
7、应来检测样品。,印迹法(Blotting),通过电泳将样品中的不同蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。,Western印迹法,Werstern Blot,,LOGO,27,膜的特点,,LOGO,28,半干转 用滤纸吸Buffer来做转移体系 适合转移小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的， 时间是根据 蛋白分子大小定的； 56mA/膜 1h 湿转 将膜、胶、滤纸全浸泡在Buffer的Tank里 适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h,Werstern Blot,转移方法,
8、,LOGO,Werstern Blot,直接法,优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便,,LOGO,间接法,Werstern Blot,优点：1. 免疫特异性不受标记影响2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3. 多种标记的二抗可供选择4. 可选择不同的Marker缺点：1. 交叉反应引起的非特异性条带2. 额外的二抗孵育以及条件优化,,LOGO,显色,放射自显影 底物化学发光ECL 底物荧光ECF 底物DAB呈色 ECL:（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发
9、光，可使胶片曝光，就可洗出条带。,Werstern Blot,32,灵敏度1-5ng,目的蛋白的表达特性分析目的蛋白的组织定位目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的表达量分析,Werstern Blot,,LOGO,33,33,Werstern Blot,,LOGO,ELISA,ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,优点：快速、灵敏、定性、定量、定位，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。,,LOGO,ELISA,（1） 直接法测定抗原A. 将待测抗原吸附在载体表面；B. 加酶标抗体，形成抗原
10、抗体复合物；C. 加底物。,,LOGO,（2）间接法测定抗体A. 将抗原吸附于固相载体表面；B. 加待测抗体, 形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体；形成抗原-抗体-抗抗体复合物；D. 加底物。,ELISA,,LOGO,（3）双抗体夹心法测定抗原A.将抗体吸附于固相表面; B.加待测抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体，形成抗体-抗原-抗体的夹心复合物； D. 加底物。,ELISA,,LOGO,ELISA,（4）竞争法测定抗原A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔差未知抗原量。,39,
11、灵敏（纳克水平）、特异、简单、快速、易于自动化操作。一天之内可以检查几百甚至上千份标本，高通量检测筛选。应用：1、定量检测抗原或抗体成份。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。4、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。,ELISA,40,,输液系统,进样系统,分离系统,检测系统,数据处理系统,工作原理,HPLC是以液体为流动相，并用高压输送，色谱柱采用填充颗粒十分细小的高效分离柱，柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测.,HPLC,41,HPLC,42,HPLC的图形结果,色谱图(Chromatogram) : 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标
12、为信号强度,横坐标为时间,色谱峰,时间(分),基线,峰高,峰宽,响应值,HPLC,43,从色谱流出曲线中，可得许多重要信息： 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所 含组分的最少个数 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析 根据色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据 根据色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据(R值）,HPLC,44,在生化中,主要用在下面几处: 1纯度；2分子量；3肽谱;4分离制备蛋白质和肽；5脱盐。,Application,灵敏度0.1ng/mL,HPLC,,LOGO,45,常规质量控制方法,Thank You !,,LOGO,SOP: Standard Operation Procedure 标准作业程序,,LOGO,,LOGO,What is QCQA?,,LOGO,,LOGO,,LOGO,Thank You !,,
