1、实验内容实验一 蛋白质的沉淀与凝固 蛋白质溶液是一稳定的亲水性溶胶液，其稳定的因素有二：一是蛋白质胶粒上的电荷使之相互排斥，不易凝集成团；二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融洽相依，又在胶粒之间起了隔离作用。如果上述两种稳定蛋白质溶液的因素被破坏，蛋白质将于溶液中沉淀析出。 促使蛋白质沉淀的因素很多，大致可分为两类：第一类是可逆的沉淀反应。这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白。第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电
2、点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而变成坚实的凝块。一、 蛋白质的盐析 原理高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白变性，故常用于分离各种天然蛋白质。由于蛋白质的组成及性质不同，所以盐析时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵沉出球蛋白，饱和的硫酸铵则沉出清蛋白。 操作 1.取一试管，加入3ml 5%蛋白质溶液及3ml饱和硫酸铵溶液，摇匀静止数分钟后观察现象。 2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达饱和状态，摇匀后观察现象。（注意固体硫酸铵若
3、加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。） 3.取上项浑浊液1ml，加水2ml，观察是否复容。二. 乙醇沉淀蛋白质 原理乙醇是脱水剂，可与蛋白质争夺水化膜；此外，加入乙醇可使水的介电常数变小，蛋白质解离度降低，带电量减少。故加入乙醇能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。用此法在低温下操作可使沉出的蛋白质保持其理化特性及其生物学活性，但室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆的沉淀。 操作1. 取试管4支，标出1、2、3、4号码，按下表操作试剂 12345%蛋白质溶液（ml）111-1%乙酸（滴）-1-2-95%乙醇（ml）-2 2.将3管及4管置冰水中，放置5分钟，然后将第4管
4、的冰乙醇倒入第3管中（此步最好在冰水中进行），混匀，同时向第1及第2管中各加入未冰浴的乙醇2ml混匀，观察各管的沉淀情况并立即向第1、2及3管中各加入蒸馏水10ml，混匀，比较各管变化并解释之。三. 重金属盐沉淀蛋白 原理 在溶液的PH值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与重金属离子（Ca2+、Hg2+、Ag1+、Pb2+等）结合成盐而沉淀。 操作 取试管4支，按下表操作。试剂 （滴）12345%蛋白质溶液55551%乙酸 -101010g/L硫酸铜3-3-30g/L硝酸银-3-3混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。四. 生物碱试剂沉淀蛋白 原理能沉淀生物碱（或植物碱）或与其产生颜色反应的
5、物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。在溶液的PH值小于蛋白质的等电点时，带正电荷的蛋白质与生物碱试剂的负离子结合成盐而沉淀。 操作 取试管3支，按下表操作。试 剂 1235%蛋白质溶液（ml）1111%乙酸（滴）101010苦味酸溶液（滴）数滴-鞣酸溶液（滴）-数滴-三氯乙酸溶液（滴）-数滴混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。五. 蛋白质的加热凝固 原理 蛋白质在其等电点附近加热，即发生变性凝固，在加热过程中，随着蛋白质变性作用的深化，使已变性的蛋白质分子间凝聚成凝胶状的蛋白块。但应注意，当蛋白质溶液远离等电点而带有很多同种电荷时，加热虽可使其变性，但因同种电荷的排斥作用并不发生凝固
6、现象。 操作取试管4支，按下表操作试 剂12345%蛋白质溶液（ml）22221%乙酸（滴）-1-2-10%乙酸（ml）-0.5-100g/LNaOH（ml）-0.5混匀后各管分别加热，观察有否沉淀析出及沉淀析出的多少、快慢并解释之。另外在第2管加热蛋白沉出后再加入5ml蒸馏水，观察是否复溶，为什麽？ 试剂 15%蛋白溶液：取出鸡蛋清用蒸馏水稀释5倍，搅匀后用纱布过滤。 2饱和硫酸铵溶液。 3硫酸铵结晶粉末。 495%乙醇。 51%乙酸和10%乙酸。 630g/L硝酸银溶液。 710g/L硫酸铜溶液。 8100g/L氢氧化钠溶液。 9苦味酸饱和溶液及鞣酸饱和溶液。 10100g/L三氯乙酸溶液
7、。 （李素婷） 实验三 微量凯氏定氮法 原理蛋白质样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，而氮转变为氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵，再与纳氏试剂显色，与标准液比较，可求其含氮量。如测血清蛋白，可将总氮量减去非蛋白氮量，再乘以6.25即得蛋白质量。 操作1取血清或血浆0.2ml，以0.9%NaCl溶液稀释至10ml（稀释50倍）2取消化管1支，加入稀释血清0.5ml，50%硫酸0.5ml, 玻璃珠1枚，在电炉上消化。3当出现白雾并充满消化管时，消化管口加玻盖，再继续消化3分钟左右，冷却，加3%H2O212滴，再消化至出现白雾，加盖，继续消化至无色透明，完全冷却后加蒸馏水至17.5ml，再加纳氏试
8、剂至25ml，混匀，与标准管比色。4标准管制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，以蒸馏水作空白调零，500nm波长比色。5标准曲线制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，取5支干净试管操作如下试 剂（ml）12345标准硫酸铵应用液-0.81.21.62.018N H2SO40.10.10.10.10.1蒸馏水3.42.62.21.81.4混匀，各管加奈氏试剂1.5 ml, 以第1管为空白，用500nm波长比色得各管光密度值，以浓度为横坐标，测得各管光密度为纵坐标，作一标准曲线。6测得测定管的光密度值，于标准曲线上查出含氮量。计算 蛋白质g %=含氮量6.25100 试剂150%硫酸
9、2. 18N硫酸溶液：取比重1.84的分析纯浓硫酸50毫升慢慢加到50毫升蒸馏水中。3. 3%H2O24. 0.9%NaCl5. 奈氏试剂： 奈氏试剂贮存液：于500毫升锥形瓶内加入碘化钾150克，碘110克及蒸馏水100毫升和纯汞150克，振摇到碘色将变时（约15分钟），混合液发生高热，将锥型瓶放入冷水内继续振摇至棕红色的碘转变成带绿色的碘化钾汞溶液时为止。将上清液倾入2000毫升的量筒中，用蒸馏水洗涤瓶内壁及瓶内沉淀物数次，将洗液一并倾入量筒中，加蒸馏水至2000毫升。奈氏试剂应用液：取10%氢氧化钠溶液700毫升，加入奈氏贮存液150毫升，摇匀，用蒸馏水稀释到1000毫升。如浑浊，可静止
10、过夜，取上请液备用。6硫酸胺标准贮存液：（1毫升=1毫克氮） 取分析纯硫酸铵置烤箱中110oC，干燥半小时，取出置干燥器内待其冷却，准确称取干燥的硫酸铵4.716克，置1000毫升量瓶中，加蒸馏水300毫升使之溶解，加纯浓硫酸1毫升，再加蒸馏水至刻度。(NH4)2SO4分子量132.06；其氮占28。 故：132.0628=4.716X X=1 即4.716克硫酸铵中含氮1克 7硫酸铵标准应用液： 取硫酸铵标准贮存液1.0毫升，于100毫升容量瓶中，加纯硫酸0.1毫升，以蒸馏水稀释至刻度，于带磨口玻璃瓶中保存。（周晓慧）实验四 双缩尿法测定蛋白质含量 原理凡含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中
11、能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色的复合物，这一反应称为双缩尿反应。蛋白质含有肽键，因而一切蛋白质均可与双缩尿试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，经与同样处理的标准蛋白溶液相比，即可求出样品中的蛋白质含量。 操作 1.标准曲线的制备 取6支试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液试 剂123456标准蛋白溶液（10mg/ml）0.00.10.30.50.70.9生理盐水（ml）1.00.90.70.50.30.1双缩脲试剂(ml)4.04.04.04.04.04.0蛋白浓度(mg/ml)0.00.20.61.01.41.8混匀后，于37水浴中保温15分钟，在520nm波长下比色，以第一管调
12、零，测得各管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2.样品测定取待测蛋白样品0.1ml，加生理盐水 0.9ml，再加双缩脲试剂4.0ml，于37水浴中保温15分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量。 试剂 110g/L标准蛋白溶液：准确称取经凯式定氮法校正的结晶牛血清蛋白或人血清蛋白10g，用生理盐水配成浓度为10mg /ml。 2双缩尿试剂：称取CuSO45H2O 2.5g、蒸馏水100ml加热助溶。另取酒石酸钾钠10g、碘化钾5g，溶于500毫升蒸馏水中，再加200 g/L NaOH 300ml混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加蒸馏水至100
13、0 ml。 3.生理盐水（周晓慧）实验五 改良酚试剂法测定蛋白质含量 原理蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸等残基能在碱性条件下与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。 操作 （一）制作标准曲线 1取试管6支分别编号，按下表加入试剂： 试 剂（ml）123456标准蛋白溶液（1mg/ml）0.00.20.40.60.81.0生理盐水1.00.80.60.40.20.0试剂A0.90.90.90.90.90.9 混匀后置于50C水浴10分钟，冷却后各管加入试剂B 0.1ml，室温放置10分钟，各管
14、加入试剂C 3ml，立即混匀，置37C水浴箱恒温10分钟。冷却后以1号管为空白，在分光光度计上以波长650nm比色，读取光密度值。 2.以各标准样品蛋白质浓度为横坐标，各管光密度值为纵坐标作标准曲线。（二）样品测定 取试管2支，按下表加入试剂试 剂（ml）测定管空白管稀释的待测样品1.0-生理盐水-1.0试剂A0.90.9 混匀后在50C水浴箱中保温10分钟，取出冷却后，两管各加试剂B 0.1ml，室温放置10分钟，再各加试剂C 3ml，立即混匀，置37C水浴箱保温10分钟，冷却后在分光光度计上以波长650nm比色读取光密度值。 结果与计算根据测定管光密度值查标准曲线，由标准曲线计算样品蛋白质
15、含量。注意事项 1.测定蛋白质的浓度应在0.0150.110mg/ml范围。 2.各管加酚试剂必须快速，并立即摇匀，不应出现混浊。试剂 1.标准蛋白溶液：称量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙种球蛋白10mg，用生理盐水配制成1mg/ml的标准蛋白溶液。 2试剂A：2g酒石酸钾钠及100g Na2CO3溶于500ml 1mol/L NaOH中，用蒸馏水稀至1000ml。 3试剂B：2g酒石酸钾钠及1g CuSO45H2O分别溶解于少量水中，混合后加蒸馏水至90ml，再加10ml 1mol/L NaOH即成。 4试剂C： （1）市售的酚试剂，用1mol/L NaOH滴定相当于2.5 mol/L H
16、Cl，按110稀释即可。 （2）称取Na2WO42H2O 100g及Na2MoO42H2O 25g溶于700ml蒸馏水中，加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml混匀后，置圆底烧瓶中回流10小时，加入硫酸锂（Li2SO4H2O）150g、蒸馏水50ml及浓溴水数滴，继续煮沸15分钟去溴，冷却后稀释至1000ml，过滤，溶液应为金黄色，置棕色瓶中保存，使用时稀释至1mol/L。（周晓慧）实验六 紫外分光光度法测定蛋白质含量 原理 蛋白质在280nm处的特征性吸收峰，是由于其中所含有的芳香族氨基酸：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的，其光密度和蛋白质的浓度呈线性关系，可用于蛋白质的定量
17、。对于同样浓度的不同蛋白质，如果酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸含量不同，其光密度值也不同，选用标准蛋白质时必须注意。若样品中含有其它具有紫外吸收的杂质，如核酸、核苷酸等，可产生较大的误差，故应作适当的校正。蛋白质样品中含有核酸时，混杂的核酸在280nm处也有吸收，对此法有一定的影响。因此，一般情况下在测定A280的同时，测定A260，计算A280/A260 的比值。如果A280/A2601.5，可忽略不计核酸的影响，A280/A2601.5时，需按下列公式计算蛋白质的浓度： 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260 操作 1标准曲线的制备： 取试管8支按下表加入试剂试 剂（ml）
18、12345678标准蛋白液（1mg/ml）0.0000.5001.0001.5002.0002.5003.0004.0000.9%NaCl溶液4.0003.5003.0002.5002.0001.5001.0000.000蛋白浓度(mg/ml)0.0000.1250.2500.3750.5000.6250.7501.000混匀，选波长280nm，用1cm石英比色杯，第一管为空白，分别测定各管溶液光密度值。以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。 2样品测定：将待测的蛋白样品用0.9%NaCl溶液稀释，使其浓度在蛋白标准曲线范围之内，混匀后按上述方法测定光密度值，查标准曲线，得出样品
19、的蛋白浓度。 试剂 1.标准蛋白液：准确称取结晶牛血清白蛋白 （精确0.001）用0.9% NaCl溶液配置成1mg/ml的溶液（需用凯氏定氮法校正）。 2. 0.9% NaCl溶液。（周晓慧）实验七 凝胶过滤层析分离血红蛋白与硫酸铜 原理血红蛋白（分子量64500）与铜溶液混合物，通过葡聚糖凝胶G-25层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，进行分离大分子的血红蛋白和小分子的硫酸铜。操作1凝胶的准备：葡聚糖凝胶G-25 1g，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，于沸水浴中煮沸2小时（或在室温放置6小时），待冷却至室温时装柱。2装柱：在层析管底部填少许玻璃棉，关闭玻管的出口。然后自顶部缓缓加入葡聚糖凝胶G-25
20、悬液。待底部凝胶沉积12cm时，打开出口。当凝胶上升至距柱顶3cm时即可。3样品的制备：（1） 血红蛋白的制备：取草酸钾抗凝血2ml于离心管中，3000转/分离心5 分钟，弃去上清液，再用生理盐水洗血细胞两次。将血细胞用5倍体积蒸馏水稀释。（2） 铜溶液的制备：将硫酸铜3.73g溶解于10ml热蒸馏水中，冷却后稀释到15ml。另取柠檬酸钠17.3g及碳酸钠（Na2CO3H2O）10g，加水60ml，加热使之溶解，冷却后稀释到85ml。之后把硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中。（3）取血红蛋白稀释液、铜溶液按2：3体积混合，作为样品。4加样：（1）将层析柱出口打开，使床表面的蒸馏水流出，直
21、到床面正好露出，再关闭出口。（2）用小滴管将样品（约0.8ml）沿柱内壁缓缓地加于床面上，然后打开流出口，使样品进入床内，直到床面重新露出。（3）用上述方法加入约2ml蒸馏水。当将近流干时，反复加入多量蒸馏水，进行洗脱，直至红蓝两条带分开为止。试剂1 葡聚糖凝胶G-25。2 草酸钾。3 生理盐水。4 硫酸铜。5 柠檬酸钠。6 碳酸钠。（王鲁华）实验八 凝胶过滤层析分离血红蛋白与鱼精蛋白原理本试验使用交联葡聚糖凝胶（Sephadex G-50）将血红蛋白（红色，分子量为64500）与二硝基氟苯-鱼精蛋白，从混合液中分开。由于它们的分子量及颜色的不同，可以观察到血红蛋白洗脱较快，而鱼精蛋白洗脱较慢
22、。操作1凝胶的制备称取Sephadex G-50 1g，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，于沸水浴中煮沸1小时（此为加热法溶胀，如在室温溶胀，需浸泡3小时），取出冷却至室温后再行装柱。2装柱取直径0.81.5cm，长度1720cm的层析管，在底部填砂芯或少许玻璃棉，装上带有螺旋夹和细玻管的橡皮管，垂直置于铁架上，柱中先加入少量水，充满细玻璃管，并残留部分水于层析管下部，以排除层析柱底部及细玻管内的气泡。然后关闭玻管的出口，边轻轻搅拌以蒸馏水稀释的葡聚糖凝胶悬浮液，边将其自层析管顶部缓缓加入，待底部凝胶沉积12cm时，再打开出口，一面继续加凝胶，待凝胶上升至距玻管顶3cm左右即可停止，最后以蒸馏水
23、平衡凝胶柱。加入凝胶时速度应均匀，并使凝胶均匀下沉，以免层析床分层，同时防止柱内有气泡。如层析床凝胶表面不平整，可在凝胶表面用细玻棒轻轻搅动，再让凝胶自然沉降，使表面平整。3样品的制备（1）血红蛋白（Hb）溶液的制备：取草酸钾抗凝血2ml于离心管中，以2500r/min离心5分钟，弃去上层血浆，用0.9NaCl 5ml洗血细胞，重复三次，每次要把血球搅起，以3500r/min离心5分钟后尽量弃去上清液。加蒸馏水5ml，充分混匀，放冰箱过夜使沉淀的血球充分溶血，备用。（2）DNP-鱼精蛋白的制备：称取鱼精蛋白0.15g，溶于10NaHCO3溶液1.5ml中（此时该蛋白质溶液pH应在8.59.0左
24、右）。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微热的95乙醇3ml中，待其充分溶解后，立即倾入上述蛋白质溶液中。将此管置于沸水浴中，煮沸5分钟，冷却后加2倍体积的95乙醇，可见黄色的DNP-鱼精蛋白沉淀。离心5分钟，弃去上清液，沉淀用95乙醇洗2次，所得沉淀用1ml蒸馏水溶解，即为DNP-鱼精蛋白溶液，备用。（3）取血红蛋白稀释液0.1ml，加DNP-鱼精蛋白溶液0.2ml，充分混匀，此混合液即为样品溶液。4加样加样时先将层析管出口打开，使床表面蒸馏水流出，直到床面正好露出，用下口较大的滴管，将上述样品（约0.3ml）缓缓沿层析柱内壁小心地加于床表面，注意尽量不使床面搅动，然后打开出口，使样品进入床内，
25、直到床面重新露出，重复上法加12倍于样品体积的蒸馏水，这样可使样品的稀释最小，而样品又完全进入床内。当少量蒸馏水将近流干时，加入蒸馏水使其充满层析柱上面空间，开始洗脱。5洗脱与收集反复加入蒸馏水洗脱，调节出口处螺旋夹，使洗脱速度在0.51.0ml分左右（约1015滴分）洗脱时可观察到黄、红两条区带逐渐分开，当红色的血红蛋白区带到达玻管下端时，用带刻度的离心管收集流出液，直至红色液全部流出为止，待测。再换以另一离心管，收集黄色的DNP-鱼精蛋白洗脱液，直至黄色液全部洗出为止，此液可回收重新使用。结果与计算取一试管吸取前述血红蛋白液0.1ml，加蒸馏水至5ml作为标准管（上柱前液），取收集的血红蛋
26、白液加蒸馏水至5ml。以蒸馏水为对照，测得标准管及收集管液体在540nm波长处的光密度值，按下列公式计算血红蛋白的回收率。血红蛋白回收率（）洗脱收集液光密度值上柱前液光密度值 100试剂1 Sephadex G-502 草酸钾抗凝血液3 0.9NaCl4 鱼精蛋白5 10NaHCO36 2，4-二硝基氟苯7 95乙醇（王鲁华）实验九 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 原理 血浆中的各种蛋白质，它们的等电点都在pH7.0以下，如将它们置于pH8.6的缓冲液中电泳时，它们都解离成负离子，向正极移动。在同一pH溶液中，由于各种蛋白质所带电荷的数量不同以及分子大小不同，因此它们在电场中的移动速度也有差别，利用
27、这种性质可以把各种蛋白质分开。 醋酸纤维薄膜作为电泳支持物具有电渗小、分离速度快，区带清晰、操作简便等优点。醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白分为白蛋白及1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白-球蛋白等5条区带。固定染色之后，不仅可看到清晰的色带，并可将各带染料溶于碱溶液中进行定量测定，从而计算出血清中各种蛋白质的构成比。 操作 1准备与点样： （1）将薄膜切成28cm的小条，在薄膜无光泽面距端1.5cm处用铅笔画一横线，表示点样位置。 （2）将薄膜无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液中(缓冲液盛于培养皿中)。 （3）将充分渗透(指膜上没有白色斑痕)的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻片上
28、使点样线驾空。 (4)吸取少量血清滴于普通玻璃板上，用X光片或加样器的钢口蘸取样品，平直印于膜上，待血清全部渗入膜内，移开点样器。 2电泳：将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面(即点样面)向下，点样端置于阴极。槽架上四层纱布怍桥垫，膜条与纱布需贴紧，待平衡5分钟后通电，调节电压至90V，或电流为0.40.6mA/cm宽，通电1小时左右关闭电源。 3染色：通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟取出，首先用自来水冲洗一下，然后立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景变白为止。用滤纸吸干薄膜。 4定量：（1）取试管6支，编好号码，分别加入0.4m
29、ol/L氢氧化钠4ml。（2）剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪平均六小的薄牵，分别浸入上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。（3）约半小时后，用分光光度计进行比色，在650nm波长下读取各管的光密度，用空白薄膜条洗出液为空白对照。 计算 光密度总和T=A+1+2+ 各部分蛋白质的构成比为： 白蛋白=A/T；1球蛋白=1/T：依次类推。 临床意义 1 正常值：白蛋白为0.540.61；1球蛋白为0040.06；2球蛋白为0070.09；球蛋白为0.100.13；球蛋白为0.170.222 肝硬化时，白蛋白显著降低，球蛋白升高23倍。肾病综合征时，白蛋白降低，2、球蛋白升高。 试剂 1.巴比妥缓
30、冲液（pH8.6）：巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g、蒸馏水加热溶解后再加水至1000ml（离子强度0.06）。 2，氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.5g、甲醇50 ml、冰醋酸10 ml、蒸馏水40 ml。 3漂洗液：95%乙醇45 ml、冰醋酸5 ml、蒸馏水50 ml。 40.4mol/L NaOH。（王文勇）实验十一 血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定 原理 为了研究蛋白质的性质、结构及功能，首先要从大分子体系中分离纯化这种蛋白质，并且须保持天然蛋白质原有的结构与生物学活性（即不变性）是比较复杂的，蛋白质分离主要是利用各种蛋白质性质的不同，尤其是蛋白质在不同酸、碱环境中的性质和
31、电学性质的差异。分离蛋白质常用的方法有：盐析、层析、超离心、超过滤等，根据目的要求不同，可分别采用这些方法或几种方法配合使用。本实验以分离纯化血清-球蛋白为例，介绍一种蛋白质的分离纯化方法。过程包括：盐析、离心分离、凝胶层析、离子交换层析纯化、浓缩和电泳鉴定等几个步骤。 （一）盐析法粗提蛋白质 血清中含有清蛋白和球蛋白（a- b- g- 、球蛋白），由于它们所带电荷不同，分子量不同，在高浓度盐溶液中溶解度不同，因此，可利用它们在中性盐溶液中（常用硫酸铵、硫酸钠等）溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。由于各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度不一，调节盐的浓度可使不同
32、的蛋白质沉淀析出，达到分离目的。 本实验采用在血清中加入50%饱和度的硫酸铵，使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解于溶液中，经离心分离获得沉淀部分，即为含有g-球蛋白的粗制品。 （二）凝胶过滤层析法脱盐用盐析法分离而得到的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须首先去除。常用的方法有透析法、凝胶过滤层析法等。凝胶过滤层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。凝胶有多种，葡聚糖凝胶（Sephadex）是常用的一种人工合成的凝胶，脱盐用sephadexG-25层析柱，它的骨架是-
33、1，6-糖苷键联接成的直链葡聚糖，由环氧氯丙烷作交联剂制成的多孔网状结构的多聚物。结果大分子物质（蛋白质）直径大，不能进入凝胶颗粒的网孔中，垂直向下移动，速度快。而小分子物质（无机盐）可扩散入凝胶颗粒网孔中，流经的路程长、速度慢，从而使混合物中各组分按分子大小不同的顺序流出，蛋白质先流出，无机盐后流出，得到除去盐的蛋白质溶液 （三）离子交换层析纯化蛋白质纯化蛋白质的方法很多，如各种层析方法：离子交换层析、凝胶层析、吸附层析及亲和层析等；各种电泳方法：可选用制备区带电泳、等电聚焦电泳及蛋白质结晶等。本实验采用DEAE-纤维素二乙基氨乙基，-CH2-CH2-N+H（CH2-CH3）2 离子交换层析
34、法进一步纯化g-球蛋白。蛋白质是两性电解质，本实验所调整的溶液pH为6.5，此时溶液中的清蛋白pI 4.7、-球蛋白pI 5.06、-球蛋白pI 5.12皆带负电荷，而r-球蛋白pI 7.3带正电荷。DEAE-纤维素是一种阴离子交换树脂，本身带有正电荷，可与溶液中带负电荷的离子结合，如-球蛋白、-球蛋白等。而带正电荷的r-球蛋白则不能结合在树脂上，因而在洗脱的溶液中只留有r-球蛋白，以达到纯化的目的。 （四）浓缩干燥的葡聚糖凝胶颗粒内部有孔隙容积。当把干燥的葡聚糖凝胶颗粒投入稀的高分子溶液中时水分和低分子量物质就会进入凝胶颗粒内部的孔隙直到充满为止，而高分子物质则排阻于凝胶颗粒之外，因此，经十
35、几分钟后通过离心或过滤就可分离出膨胀的凝胶颗粒，得到浓缩了的高分子溶液。 利用葡聚糖凝胶G-25型干胶吸水膨胀，而不吸入蛋白质的特性，在已纯化的-球蛋白溶液中加入适量葡聚糖凝胶G-25型干胶。离心约5分钟（3000转/分）。上清液即为浓缩的-球蛋白溶液。 （五）电泳法鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）利用醋酸纤维素薄膜作为电泳支持物，将未分离纯化的原血清样品点样于膜上进行电泳时，可将血清蛋白分为清蛋白、1、2、 及-球蛋白等5条区带，而用分离纯化后的-球蛋白溶液点样电泳，在-球蛋白相应位置仅呈现1条区带（电泳迁移率相同），将区带洗脱，或直接扫描，可计算出各种蛋白质的百分含量。 操作（一）盐析粗提：取
36、正常人血清2.0ml于小试管中，边摇边缓慢加入饱和硫酸铵溶液2.0ml，使之成为半饱和溶液。混匀后室温放置10分钟，3000转/分，离心10分钟，弃去含有清蛋白的上清液。于沉淀中加蒸馏水1.0ml，振摇使之溶解，此液即为粗提的球蛋白溶液。（二）脱盐：1.凝胶处理：（老师准备），称取葡聚糖凝胶G-25型6.0g于小烧杯中，加100ml蒸馏水，置沸水浴1小时，并以玻璃棒轻轻搅动以使气泡逸出。冷却置室温，待凝胶大部下沉后，弃去含有细微悬浮凝胶颗粒的上清液。加蒸馏水约100ml轻轻搅动片刻，再弃去含有细微颗粒的上清液。加0.02mol/L pH 6.5醋酸铵溶液100ml。轻搅拌片刻，待大部分凝胶下沉
37、后，弃去含有细微颗粒的上清液，再加醋酸铵溶液100ml重复处理一次，最后加入醋酸铵溶液20ml，此即为已溶胀备用的凝胶溶液。2.装柱：取一层析管（1.520cm 或25ml碱式滴定管），垂直夹于铁架台上，关闭玻管出口，先加入醋酸铵溶液约10ml,打开出口让硫酸铵溶液充满下部容器然后排出，以排除空气。关闭出口，自玻管顶部缓慢加入溶胀后的葡聚糖凝胶混悬液，边加边搅拌，保持凝胶均匀连续地沉降，当混悬液达玻管顶部时，打开出口，以螺旋夹控制流速10-20滴/分，继续加混悬液，待凝胶面上升至距玻管顶口3cm左右时即可停止，柱床面留一层液体。3.平衡：用螺旋夹控制流速8-10滴/分，用醋酸铵溶液（ pH6.
38、5）流洗平衡几分钟后，即可使用。凝胶管柱上端平衡液始终不少于1cm高度，不得出现干胶和断层，并应保持凝胶面平整。4.上样：即样品上柱，待层析液（醋酸铵溶液 pH 6.5）上端的液面刚好下降至凝胶表面时（切勿进入空气）将凝胶层析管下端的螺旋夹拧紧，这时将盐析所得的球蛋白溶液用滴管小心加入层析柱内，打开螺旋夹，用试管收集流出的液体，当球蛋白溶液恰好完全进入凝胶柱上端面内时，立即用2ml醋酸铵溶液小心冲洗管壁上的蛋白质，然后再重复冲洗一次。5.洗脱：反复加入多量醋酸铵溶液进行洗脱，洗脱速度为10滴/分，每当试管内收集到1ml(约15滴)液体时，应取1滴置磁反应板上加入200g/L磺基水杨酸试剂检验有
39、无蛋白质流出，如有则呈白色混浊。每收集1ml换一试管，并不断检查蛋白质，直到反应呈阴性为止。再分别从每个试管各取出1滴蛋白液置磁反应板上加入50g/L醋酸钡，直至检查出现白色的BaSO4沉淀为止，将含蛋白质而无硫酸铵的溶液合并，此即为已脱盐的球蛋白溶液，待进一步纯化。6凝胶的再生与保存：葡聚糖凝胶可柱内再生，故凝胶层析柱可重复使用，每次用完后以醋酸铵溶液进行充分洗涤，留待再用。为防止凝胶霉变，可用含0.02%叠氮化钠的醋酸铵溶液进行流洗后再放置。长时间不用，宜将凝胶从柱内倒出，以湿态保存，只要在其中加适当的抑菌剂如0.02%叠氮化钠置4oC冰箱内，可放置几个月至一年，不需要干燥。如凝胶柱有轻微
40、污染，则可用0.2mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl的混合液处理。 （三）纯化 1DEAE-纤维素处理：称取DEAE-纤维素3.0g，加0.5mol/L盐酸溶液45ml，搅拌后放置30分钟，加蒸馏水250ml，搅匀，待纤维素大部分下沉后，弃去含有细微颗粒的上层液体，如此反复2-3次，用蒸馏水洗至流出液pH4.0，再加0.5mol/L氢氧化钠溶液45ml，搅拌后放置30分钟，弃取上层液体，再用蒸馏水洗至pH7.0，弃上层液体后加醋酸铵溶液约200ml,用1mol/L的醋酸调至pH6.5（约5ml），留待装柱。 2装柱：与葡聚糖凝胶层析装柱法相同。 3.平衡：用pH6.5醋酸铵溶液、平衡
41、的方法、时间同葡聚糖凝胶层析。 4.上样：将脱盐收集的球蛋白溶液上柱，方法过程与脱盐法相同。 5.洗脱：用pH 6.5醋酸铵溶液反复加入多量进行洗脱，流速20-30滴/分，方法与上述脱盐法相同，同样用200g/L磺基水杨酸检查有无蛋白流出。此次收集的即为纯化的-球蛋白溶液，留待浓缩及鉴定。 6.DEAE-纤维素的再生与保存：先用1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4Ac溶液流洗几遍，再用0.02mol/L醋酸铵溶液（pH6.5）洗涤平衡后可重复使用。 （四）浓缩 将纯化后的-球蛋白溶液量其体积，每毫升加葡聚糖凝胶G-25干胶颗粒0.25g，吸收水分，摇动2-3分钟，离心5分钟（3
42、000转/分），上清液即为浓缩的-球蛋白溶液，用吸管吸至另一个小试管中，留待电泳鉴定。 （五）电泳法鉴定 1准备：在28cm醋酸纤维薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻划一条线，表示点样的位置。 2.浸泡醋酸纤维薄膜：将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上，使膜条自然浸湿下沉，浸泡一般要大于2小时，最好过夜，充分浸透至膜上没有白色斑痕。 3点样：将充分浸透的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，吸取少量血清滴于玻片上，用X光片或加样器的钢口蘸取血清，平直印在点样线上，待血清完全浸入薄膜后移开。另点样一条膜条，吸取少量已纯化的-球蛋白溶液滴于玻片上，其它操作同上述血清点样。注意点样位置与血清薄
43、膜一致，以便比较迁移率。 4电泳：将点样膜条置于电泳槽上，使点样面向下，点样端置于阴极，槽架上用四层滤纸或两层纱布作桥架，膜条与滤纸需贴紧，平衡约5分钟后接通电源，调节电压100-110V，稳定电流为0.4-0.6mA/cm宽膜条，通电50-60分钟后关闭电源停止电泳。 5染色：用镊子将电泳后的膜条取出，浸于盛有氨基黑10B 的染色液中，染色5分钟取出，先用蒸馏水冲一下，立即按顺序浸入不同杯的漂洗液中漂洗4-5次，直至薄膜背景漂净为止，用滤纸吸干薄膜。对照观察血清薄膜与-球蛋白薄膜两者的电泳区带分析结果。血清-球蛋白分离、纯化及鉴定操作流程2.0ml血清加2.0ml饱和硫酸铵溶液 混匀，放置10分钟 3000转/分 离心10分钟 盐析 沉淀（球蛋白），加1ml水溶解 上清液为清蛋白部分，弃去 脱盐 上葡聚糖凝胶柱 用0.02mol/L、pH6.5醋酸铵溶液洗脱，收集含蛋白质部分 纯化 上DEAE-纤维素柱 用0.02mol/L、pH6.5醋酸铵溶液洗脱，收集含蛋白质部分 浓缩 用葡聚糖凝胶G-25干胶浓缩 鉴定 用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 注意事项
