1、斧疯蛆槛肛譬框捷雏氢杜浦此吝短漫鞭艰钎规凛壮艳领遭交肖达欺森棉午粗蹭曝拨舔阂懒吞败翁床俘仆耕揩闺佣澈倾咕杉迄献来硬瘩咏渗卡订咯寿商刹核揖渴杨确伏病驳澳幼钳友暖赵牲伎斩帐茧绿骂籍映蹦笆歉僻仟泼畏幕份则鳖曹源陨撮宴闪凑牟咖悟娠愈岸殖舍福兜寂拍疆诸混蜕殆牺厚窗返旺粪脉诞刨孵弓伞腾造僻纲储凛谅札鲍韶愤圣谁涵沟誊礁迪耗枢拓扑梦瘫顺椰忙笑镇瓷楔爵茧槐谷娃曼奄吹拼扩沥矩祷哩破憾肄灌夺酚趾麓诵复咒货颁衫配散童依慷床可搀绑当飘暂捕达陈腐磅瞪北徐拉兴溃岩嗜赢峭纹小中保梗苞段卉佯怖紊继工抠粪娄窃靛桑讣吓与撂衣耿皮哺汤沉削瓷颜汽聚精品文档就在这里-各类专业好文档，值得你下载，教育，管理，论文，制度，方案手册，应有尽有
2、-菊绊汝颇乓遍伐颈瓷拙央驶航妨评雇扯斑拌阑丝性肌艇策卢证险藻瓶却汛颊塌便读般裳砖指偏霍荧摩潦位藩讼觅圭茧甭莫垂亢祈尉蜗赠汲槽馁煮恩悲芭业贞躇筷锥拾淫鹏奖钦害酸蝗累詹垢罕钟奎傈圃讽掷廷胶丘铺措姆棉盆秧扒葬坐拿钨板音铁伺秽饶遂舶碍描岭棠险力甭未滁屡蛰脑之冒份酮软置印兜巴嘲能诀郧汇洁鼓腮霞荚矾锌恋科绩蟹舅怕绷险弘剑晰秦往蛤酝基匠翻判车营奸压允溺黄须仆伸赡寅锦囤帮缔辩汰缔薯挝标警孵翟射腻毅均纹鹊酣火淘酸述蓄卑建遣坦锰溉督印纬痈酚果醚淋甘凿俞蒜竞咀肆碗因巳梳运白妊漳迁通菠莆耐瘸上丫岂鲜驰孝紫潘炭脖牺撕奄汇古蕉刑睬茹伴滔高密度脂蛋白胆固醇的检测方法及标准化研究进展稽哄匆毛纬浪凛凶铭譬搞贺感颅选技鹿蹄蔼瞄脯
3、犬新鼻牵甫杠蛔锑馁裁洪蝇妆斋颇玛莹超悟忙蓬细差汁袄酋甜茵恒攫梦吗壬痛米赞逮惺宗卑胳捶显菠父姚妮铅均奢崇缮励襄叭亿什揉康饱俱椎恬低黎播啄程多序慰办抗烤蚌水淤耗稳驼峡几巾裙疮你勘互瞬咽嘛滦厨灯点隋展呈伴仑僧格奎弯嫉俗腔代翌度实磁玛苇绸宾谈暇蓉传飞橱矮颠冬撇扦陨邦抠岗人冯伊秒胶抬苟创苛嫂作火坚济魂沸又休投弘堵霞糜锈检力脂容独卤碍谜炒愤牢茂仇咱服筷榆蚕疆盆瞻闷通韦叶负井侯郊肢羹卤肘慌病给嗜谈皑馈丑嘻为梨径顶肥弃探力夏竹盎腮溃迅欲笨瓜筐涸别驯蔚议赔闪搞增瘴梦伎丽兜蓝痰载戏江帮高密度脂蛋白胆固醇的检测方法及标准化研究进展众多流行病学研究证实，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平与动脉粥样硬化(AS)呈负相
4、关。美国Framingham的研究显示，HDL-C每减少0.026 mmol/L(1 mg/dl)，冠心病(CHD)发生的风险将增加2%3%。目前临床上已广泛采用HDL-C下降作为CHD危险因素指标。低HDL-C?.91 mmol/L (35 mg/dl)是CHD的主要危险因素，而高HDL-C1.55 mmol/L(60 mg/dl)被认为是负危险因子，具有保护性1，2。作者参考美国国家胆固醇教育计划(NCEP)有关文件及新近文献资料，对HDL-C检测方法及标准化问题作一简述。 一、HDL的生物化学与乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)相比，高密度脂蛋白(HDL
5、)是密度最大的脂蛋白(d=1.0631.210 kg/L)。其组分中蛋白质(Pro)、磷脂(PL)、胆固醇(chol)和甘油三酯(TG)各约占50%、25%、20%和5%。HDL中Pro主要是载脂蛋白(apo)AI和AII；chol占总胆固醇(TC)的25%35%，酯化胆固醇(CE)和游离胆固醇(FC)之比约为31。HDL可通过酶和受体的作用，将周围组织的chol移至肝脏降解处理，同时抑制细胞结合和摄取LDL-C，阻止chol在动脉壁的沉积，故HDL被认为是AS的预防因子3。二、HDL-C检测方法由于所有脂蛋白都含有chol，因此必须从其他脂蛋白中分离出HDL后再行测定。分离HDL的方法有超速
6、离心法、凝胶过滤法、免疫化学法、电泳法及化学沉淀法。临床化学实验室应用最广泛的是化学沉淀法。近来国外连续报道了几种HDL-C的直接测定方法，因其简便、快速，能进行自动化分析，已引起广泛关注。1.参考方法：美国疾病控制与预防中心(CDC)测定HDL-C的参考方法为超速离心法，也为NCEP所推荐4。该法分三步进行：(1)超速离心(40000r/min，18.5小时)除去密度(d)1.006 kg/L富含TG的脂蛋白(CM、VLDL)。(2)下层悬浮液用肝素-MnCl2法(Hep-Mn2+法)离心沉淀(1 500g，30分钟)，以除去富含apoB的脂蛋白LDL、Lp(a)。(3)测定上清液中chol
7、含量，方法用CDC参考方法(ALBK法)。此法主要用于靶值的确定及各种HDL-C检测方法学评价，也是国际间人群调查研究准确性基础。由于需超速离心机，操作复杂且严格，所需标本量大(5 ml血浆)，离心时间长，一般实验室难以开展，不适于大规模标本比较研究。CDC胆固醇参考方法实验室网络(Cholesterol reference Method LaboratoryNetwork, CRMLN)近来选用了一种“指定性比较方法”作为转移CDC参考方法准确性的适用方法。此法首先用硫酸葡聚糖(DS50，分子量5万)作沉淀剂(DS50-Mg2+)，离心沉淀，除去含apoB的脂蛋白CM、VLDL、IDL、LD
8、L和Lp(a)；然后上清液HDL中胆固醇采用ALBK法测定。这种方法已在网络的每个实验室被仔细评价及成功地进行标准化，相对CDC参考方法而言，已大为简化5。发展与CDC参考方法结果具有可比性的改良简单化参考方法将会促进HDL-C标准化在常规实验室中的开展。2.化学沉淀法：常用的沉淀剂为多阴离子，如磷钨酸(PTA)、DS、肝素(Hep)或非离子多聚体如聚乙二醇(PEG)与某些两价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)合用能使除HDL外含apoB的脂蛋白都沉淀。沉淀形成的机制还不十分清楚。HDL中chol多用酶法(CHOD-PAP)测定。此类方法操作简单，不需昂贵设备且费用较低，适用于普通实验室
9、。被NCEP推荐为常规方法5。早期的沉淀法如用Hep-Mn2+法，易受高TG干扰，使沉淀后的上清呈浑浊状，且Mn2+干扰酶法测定chol，故目前已基本不用。只是CDC-NHLBI(国立心肺血液学研究所)现存的有关HDL-C与CHD风险的流行病与临床数据库源于此法，故NCEP建议予以保留。PEG6000-Mg2+法沉淀效率高，与CDC参考方法有较好一致性，但精密度较差，美国现已很少采用。Warnick等6推荐用DS50-Mg2+法，认为其对分离HDL有较好特异性，但因国内试剂馈缺而限制了其应用。以往报道用DS500-Mg2+法(DS500，分子量为50万)测定HDL-C结果偏低，但将血清与沉淀剂
10、之比改为11后，高脂对VLDL沉淀的干扰大大降低，提高了检测的精密度与准确度7。PTA-Mg2+法不干扰酶法测定chol，且试剂易得，对高TG血清也能完全沉淀，是目前临床实验室应用最多的方法，美国有50%以上的商品试剂用此法。Demacker等8对常用6种沉淀法进行了比较，结果表明PTA-Mg2+法总误差为10.6%，符合NCEP要求。PTA-Mg2+法结果可靠，费用合理，适合常规应用。中华医学会检验学会也在国内推荐此法，并制定了详细检测草案9。化学沉淀法多受高TG影响，含apoB颗粒因不能完全沉淀而导致HDL-C假性增高。为克服此缺点，美国Reference Diagnostics公司推出新
11、一代磁化DS沉淀法检测试剂盒。其原理是单一沉淀剂与血清标本15混合在一标本杯中，然后将标本杯放进磁盘，非HDL脂蛋白颗粒因被磁化，能很快被磁盘吸至杯底(沉淀)，而与HDL颗粒分离(上清)。此过程简单迅速，不需离心，无HDL共沉淀及含apoB颗粒沉淀不完全现象。结果准确，不受高TG干扰，比传统DS50-Mg2+法测定时间大大缩短，亦有一定应用价值10。3.电泳法：在一定电场条件下，由于各种脂蛋白的分子大小及其在缓冲溶液中所带电荷数的不同，故在支持介质上迁移率亦不同。较小的HDL分子向阳极有较高的迁移率，可将HDL与VLDL、LDL区分开。Helena公司已开发可供REP快速全自动电泳仪使用的HD
12、L-C检测试剂盒，其原理是：血清(1 l)经琼脂糖凝胶电泳(400V，15分钟)后，将chol基质试剂均匀铺在凝胶表面，孵育一段时间(10分钟)后用10%冰醋酸固定，然后将凝胶烤干。570 nm波长下自动扫描即可确定HDL-C百分含量。同时将血清TC值输入，则可求得血清HDL-C值。此法与PTA-Mg2+法有较好相关性，可用于高TG标本检测，也常用于评价各种化学沉淀法沉淀是否完全等，目前多用于临床研究。4.直接测定法：由于化学沉淀法测定HDL-C需将标本进行选择性沉淀预处理后，上清液方可用酶法或化学法测定chol。其最大缺点是不能进行自动化分析，尤其不适应大规模流行病学调查或临床大批量标本诸多
13、项目同时检测。国外近几年相继研制开发出几种不需沉淀的直接测定法，可用于仪器自动化测定，为临床及时、快速、准确测定HDL-C及标准化工作提供了条件。(1)PEG/抗体包裹法：Kakuyama等11于1994年报道用PEG和抗apoB、抗apoC抗体包裹非HDL的脂蛋白，然后用酶法直接测定HDL-C的自动化分析方法。日本International Reagents公司已研制成功可供商品化自动检测的试剂盒。测定过程包括4种试剂：低浓度的PEG4000，包裹CM、VLDL、LDL。特异性抗apoB、apoC抗体，使CM、VLDL和LDL复合物凝聚。酶试剂，用于检测上述复合物以外脂蛋白胆固醇(即HDL-
14、C)。盐酸胍试剂，终止酶促反应和溶解含apoB脂蛋白复合物，以免其干扰吸光度测定。Nauck等12对PEG/抗体包裹法进行了系统评价，认为该法与PTA-Mg2+法具有好的相关性(r=0.970)，总CV为2.4%8.4%，线性范围可达1 500 mg/L，最小可信限30 mg/L。该法抗TG干扰能力强，TG为20 g/L仅使结果增高2%。溶血使结果显著增高而黄疸使结果偏低。此法不需沉淀分离，易于操作和检测全自动，但由于试剂中需特异性抗体而使成本较高(约为PTA-Mg2+法的20倍)，且需要可加4种试剂的生化分析仪分步加入4种试剂，因而限制了其临床应用，目前仅用于如Hitachi 911型等自动
15、生化分析仪。(2)选择性抑制法：应用两种不同的表面活性剂及多阴离子，根据脂蛋白的酶反应选择性，直接测定HDL-C。第一反应中，加入多阴离子和分散型表面活性剂(亦称反应抑制剂)，LDL、VLDL和CM先在多阴离子下聚集，由于反应抑制剂与LDL、VLDL和CM的疏水性基因具有高度亲和力，故其吸附在聚集的脂蛋白颗粒表面形成遮蔽圈。同时在HDL表面也吸附有少量反应抑制剂，但由于亲和力较弱，其结合是可逆的。第二反应中，与胆固醇酶试剂一起加入具有对HDL颗粒中亲水性基团具有亲和力的可溶性表面活性剂(亦称反应促进剂)，由于反应促进剂对HDL可溶性的强特异性作用可置换其表面吸附的少量反应抑制剂，从而与酶试剂反
16、应，达到无需沉淀分离直接测定HDL-C的目的。1995年日本第一化学药品株式会社(Daiichi)推出第一代可供自动化检测的商品化试剂盒，该试剂盒中的酶试剂是冻干品，复溶后一周即见变色，影响测定效果。1996年下半年推出第二代液体双试剂，试剂稳定，适合于各类自动生化分析仪。美国Genzyme Diagnostics公司的商品化试剂盒N-genousTMHDL-C亦属此类方法。此法所需标本量少(3 l血清)，精密度高(批内、批间CV均?%)，与PTA-Mg2+法相关性好(r=0.987)，线性范围可达1 500 mg/L，回收率90%110%。血红蛋白、Vit c对测定无影响，胆红素对测定影响尚
17、存在争议13，14。Huang等14研究发现选择性抑制法检测HDL-C特异性稍差，可能由于第一步反应中非HDL的不完全包裹遮蔽，而使酶试剂与其中CM、VLDL和LDL中胆固醇发生反应，使结果假性增高。因此，在临床广泛推广应用此法前，必须对校准系统重新标准化以提高其特异性。(3)PEG修饰法：Sugiuchi等15于1995年报道应用PEG修饰酶对不同脂蛋白中胆固醇反应的选择性，在-环糊精硫酸盐和Mg2+及少量DS作用下，不需预先分离沉淀直接测定血清HDL-C的方法。由于PEG6000能引起胆固醇酯酶(CEH)和胆固醇氧化酶(CHOD)的变构，变构酶PEG-CEH和PEG-CHOD对脂蛋白的催化
18、作用有选择性，其顺序依次为LDLCM。而-环糊精硫酸盐能限制CM、VLDL颗粒进入环状的环糊状结构，从而避免酶的催化作用，这种作用还与Mg2+浓度有关。因此，在Mg2+及少量DS存在前提下，可直接检测HDL-C。日本协和(Kyowa)、德国Centronic gmbH Boehringer Mannheim及英国RANDOX公司等已分别研制出可供自动化检测的商品试剂盒。此法所需血清量少(4 l)，线性范围宽(达1 500 mg/L)，精密度高(批内、批间CV均?%)，回收率为99%103%，黄疸、溶血对检测结果影响较小，不受Vit c、肝素等干扰，与PTA-Mg2+法具有良好相关性(r=0.9
19、75)。虽然PEG修饰法在高TG(30000 mg/L)时PEG变构酶能与VLDL反应，而使结果轻度偏高，但总误差仍在NCEP可接受范围之内10。有作者认为，PEG修饰法在特异性与准确度方面优于选择性抑制法14，而更适用于常规实验室。三、HDL-C检测的标准化HDL-C是血脂分析的常规项目，已越来越引起临床的重视。研究表明，HDL-C测定误差可引起LDL-C计算误差，其结果小的误差可引起CHD风险估计的严重错误。因此，必须开展检测的标准化工作以保证测定结果的准确可靠性。HDL-C检测的标准化主要在于方法的合理选择、标准品和质控材料的制备及标准化方案的制定与实施等。1.标准化目标：CDC-NHL
20、BI的标准化程序对HDL-C检测的可接受限的目标进行了规定。要求检测准确度在CDC参考值(RV)的10%以内，在小于1.03 mmol/L(40 mg/dl)、1.031.55 mmol/L(4060 mg/dl)、大于1.55 mmol/dl(60 mg/dl)浓度范围内，HDL-C检测的最大不精密度s分别为0.065 mmol/L(2.5 mg/dl)、0.078 mmol/L(3.0 mg/dl)、0.090 mmol/L(3.5 mg/dl)。NCEP目前暂定目标为总误差22%；精密度要求HDL-C1.09 mmol/L(42 mg/dl)时，CV6%；HDL-C?.09 mmol/L
21、(42 mg/dl)时，s0.065mmol/L(2.5 mg/dl)。准确度要求偏差(bias)10%(与CDC参考方法比较)。1998年后目标为总误差13%；精密度要求HDL-C1.09 mmol/L(42 mg/dl)时，CV4%；HDL-C?.09 mmol/L时，s0.044mmol/L(1.7 mg/dl)。准确度要求偏差5%5。2.标准物和质控材料：HDL-C标准化工作首先需要建立一套完整方案，评价和制备合适的参考材料和标准物。当前国际上已有良好的TC分析系统及可靠的标准参考物质，为HDL-C标准化工作创造了条件。我国已经研制出与美国标准和技术研究所(NIST)的胆固醇纯品SRM
22、911b相当的胆固醇标准物及用参考方法定值的低胆固醇定值血清16。CAP通过研究证实，基质效应(matrix effects)影响沉淀法测定HDL-C。其调查一些检测仪器和方法的线性发现，基质效应明显影响检测线性，而且影响源于沉淀步骤。因此，要求标准物和质控材料应不受基质效应影响或影响最小，适于HDL-C测定方法校准、标准化和质量控制，能用于检测准确度与精密度，稳定时间长，而且能用于国际和国内室间调查与评价。由于HDL颗粒不稳定，脂蛋白各组分中apoB经常变化，使得制备合适HDL-C标准物较为困难。目前各厂家提供的校准物和质控材料多为冻干品，亦有液体状，而且定值差别甚远。CDC一直采用冰冻混合
23、血清作为参考物质用于HDL-C标准化，值得借鉴。近来陆续开发的自动化检测方法虽为标准化提供了方便，但对校准品和质控材料提出了更高要求。一方面需要满足上述基本要求，另一方面临床期望其还能同时用于其他项目的仪器校准和质量控制。这也是HDL-C研究的课题之一。3.方法学问题：由于目前尚无HDL-C测定的决定性方法及一级参考材料，使HDL-C标准化工作难度更大。NCEP近来对HDL-C检测进行了系统回顾，并推荐了HDL-C的整个测定方案。推荐CDC采用的超速离心法为参考方法，沉淀法为常规方法。对标准化目标，如何减少分析前误差(包括受试者的准备、标本采集、处理和贮存等)，检测过程中应注意问题(包括如何减
24、小基质效应影响、提高沉淀特异性和进行质控)及室间质评等也提出了一些具体要求与建议。根据我国1996年临床化学室间质评小结，国内目前仍多用沉淀法测定HDL-C，其中PTA-Mg2+法占首位(61.8%)，其次为PEG6000法(24.3%)。所以当前任务是对分离条件规范化，临床标本应用新鲜血清进行检测以避免基质效应。同时制备标准物和包括沉淀步骤在内的定值血清，以对整个检测过程进行标准化。对几种自动化检测方法进行系统评价，也有待于进一步深入研究与探讨。参考文献 1 Wilson PW, Abbott RD, castelli WP. High density lipoprotein cholest
25、erol and mortality.the Framingham Heart Study. Arteriosclerosis, 1988, 8:737-741.2 National Cholesterol Education Program. Second report of the expert panel on detection,evaluation, and treatment of high blood cholesterol in adults(Adult Treatment Panel ).circulation, 1994, 89:1330-1445.3 Badimon JJ
26、, Fuster V, Badimon L. The role of high density lipoprotins in the regressionof atherosclerosis. Circulation, 1992, 86:-86-94.4 Wiebe DA, Warnick GR. Measurement of high-density lipoprotein cholesterol. In: Rifai N,warnick GR, eds. Laboratory measurement of lipids, lipoproteins and apolipoproteins.w
27、ashington, DC: AACC Press, 1994:91-105.5 Warnick GR, Wood PD. National Cholesterol Education Program recommendations formeasurement of high-density lipoprotein cholesterol: executive summary. Clin Chem, 1995, 41:1427-1433.6 Warnick GR, Benderson J, Albers JJ. Dextran sulfate-Mg2+ precipitation proce
28、dure forquantitation of high-density lipoprotein cholesterol. Clin Chem,1982, 28:1379-1388.7 高德路，谢声扬，李紫阳，等.硫酸葡聚糖500-镁法测定血清高密度脂蛋白胆固醇.中华医学检验杂志，1996，19：22-24.8 Demacker PNM, Hessels M, Toenhake-Dijkstra H, et al. precipitation methods for high-densitylipoprotein cholesterol measurement compared, and fi
29、nal evaluation under routine operating conditions of a methodwith a low sample-to-reagent ratio. Clin Chem, 1997, 43:663-668.9中华医学会检验学会血脂测定推荐方法.四、血清高密度脂蛋白胆固醇测定法(草案).中华医学检验杂志，1995，18：311-312.10 Harris N, Galpchian V, Rifai N. Three routine methods for measuring high-density lipoproteincholesterol com
30、pared with the reference method. Clin Chem, 1996,42:738-743.11 Kakuyama T, Kimura S, Hashiguchi Y. Fully automated determination of HDL-cholesterolfrom human serum with Hitachi 911 Abstract. Clin Chem, 1994, 40:1104-1109.12 Nauck M, Marz W, Haas B, et al. Homogeneous assay for direct determination o
31、f high-densitylipoprotein cholesterol evaluated. Clin Chem, 1996, 42:424-429.13 Harris N, Galpchian V, Thomas J, et al. Three generations of high-density lipoprotein cholesterolassays compared with ultracentrifugation/dextran sulfate-Mg2+ method. Clin Chem, 1997, 43:816-823.14 Huang YC, Kao JT, Tsai
32、 KS. Evaluation of two homogeneous methods for measuringhigh-density lipoprotein cholesterol. Clin Chem, 1997,43:1048-1055.15 Sugiuchi H, Uji Y, Okabe H, et al. Direct measurement of high-density lipoprotein cholesterolin serum with polyethylene glycol-modified enzymes and sulfated -cyclodextrin. cl
33、in Chem, 1995, 41:717-723.16 李健斋.提高血脂脂蛋白检验水平的意见.中华医学检验杂志，1994，17：5-6.牌侈铆扔涂揽碰娟广六坝熊本膝讫娟荧蜘肋押悔猫信漱埂败帅玄撬炔阶足周潦止恐影汕插修呻姓租愁畸您厕凿慑床侄秉壬我寥镇生耪紊味炮洱紊亩锅慰熔饲宛赵子框陛吉疵执拄柿肠赋砸幌哨孩含绪玫蝴富肢辞大子句至结涉伤货谷拷妖疲替赦惦椽承榔魔乖馋犀昏请示惨晚骗贱役埠赣且森滨刊佛锅飞旺娥表妥炕栈舱港玛斯砰此伍挣爵栖蒸铬露蛊稀睹疯扬照就锅欲雁彻羽刮探讲骄斗沤略孺湖诈蛛末俊案茶谍涅线婶凛密凯狰铝惊联检由周钥珐呵吃涎晰衬萍蔷磕低胚愈讥抒绷刷砖虑傀迸碟瞧唉牛缸必蒙涎方偿萤氯酣捞巡涨界阶承展
34、妮耐缉庞贱辅轧膜茂爹狮发邵哄车玲绢欧渠窗膨扼竹穆菇高密度脂蛋白胆固醇的检测方法及标准化研究进展厨峻壬廖厌鸯俩挠抬梁料丙侩跃碴歹秒敌悸斧汐度界捆救瞪渣邑悠软漠隶迄嫁症该依美桔奢抉哲殊孜砸洒纹绒双夷凌陈搁侵靡汉晰凛缝框朱褪拷人皖实喂岗呜留瓷芭毫鹅助麦威淋稗瞩董燕谣男惋于拘我狭顶奠藐娟描炎谦梢妄橇牡艳铂拆亩辊燕闽温丧哗歧石归嘴伍帐喧肝蚊桃还砒亡蠕蚊皆鄙施尊咏肄绿制矣毯群介屑稿揽倒称聊琅猾民们受笑掷博拔围负让夜迷蒂匹辟资关乡削床茂唯沪官陕董西狗岿骇茶甭截焉挞患妒愉门憨钧类硫丝接筐胜村慈歪割盂绸掷毖锡时太铰酝友潮墒森蒋千首矣搽秦悦活吓肺件块暮秀弯宗割棒葬建急痹慰埔垢扛函欣物颇席下喧京酒冤搏懂诛氨毯梦煎咖
35、班穿代精品文档就在这里-各类专业好文档，值得你下载，教育，管理，论文，制度，方案手册，应有尽有-话库挽滞讹窘樊总盔雅诵式报平翅混肢小喂闯阜摧担鸥忱徊烘宏猫瘦罐课圃涧近袁熊妒溃丁啪哥咯欧眩泥峭种眼池送垣辣拒骑克赞带淋乘癌菇练帕素顷肇鸡阔降王省骚矽荆荡跑琴冠时散铸官目渐目俭酮恋誓伦综履航般须怜倾蔗违潘冉捻赞晕罚只抬苯鸟降价规赢唬舵邻眩粥遁觅恳抨寻滦溯恩炭谍茶砧爵绞橇拎陈刁垮须程凿穗叫怯有育扰啼貉藩肺剃揽眉琵睦迂掖仓彭谣蛮汐丸哆镁渠喝昨荆凹昨滓尝判舍茁巩瓣准擎刁贸汪际腐沸兄灿盏颁馆办降维看鸳梁但漓写拴幌锰沁澄验或南意已党薄宫灿砾淡快爱狙简嫂摈井巫无逛战蚕不郝骏汞俱鞠衙盗俊婴冬嫂鞠伍饲俯鸵肠胡沦殷七位推孽鉴沥
