1、ELISA 原理 操作规则（新手适用） 酶联免疫吸附实验 ELISA 一实验目的 酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA)是在免疫酶技术 (immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 ,ELISA 过程包括抗原 (抗体 )吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体 (抗原 ), 再加相应酶标记抗体 (抗原 ),生成抗原 (抗体 )-待测抗体 (抗原 )-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色 产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体 (抗原 )的量。待测抗体 (抗原 )的定量与有
2、色产生成正比。 二实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶， 6磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于 ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（ HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一 个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是 403nm， HRP 酶蛋白的最大吸收峰是 275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知
3、HRP 的 A(1cm 403nm 1%) 25，式中 1指 HRP 百分浓度为100ml含酶蛋白 1g，即 10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是 HRP的 A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP 纯度 (RZ)=A403nm/A275nm 纯度 RZ（ einheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度 HRP 的 RZ 值在 3.0 左右，最高可达 3.4。用于 ELISA检测的 HRP 的 RZ 值要求在 3.0 以上。 ELISA 的基本原理有三条： （ 1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并
4、保持其免疫学活性； （ 2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （ 3）酶结 合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 ELISA 法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为 ELISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而
5、且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标 本 ,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA 法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。 基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法 : 1. 包被：用 0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1 10 g ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 0.1ml， 4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤
6、缓冲液洗 3 次，每次 3 分钟。 (简称洗涤，下同 )。 2. 加样：加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中，置 37孵育 1 小时。然后洗涤。 (同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔 )。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体 (经滴定后的稀释度 )0.1ml。 37孵育 0.51 小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0.1ml， 37 10 30 分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为
7、无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ +”、“ -”号表示。也可测 O D 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm(若以 ABTS 显色，则 410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔 O D 值，若大于规定的阴性对照OD 值的 2.1 倍，即为阳性。 基本方法二 用于检测未知抗体的间接法： 用包被缓冲液将已知抗原稀释至 1 10 g ml， 每孔加 0.1ml， 4过夜。次日洗涤 3 次。 加一定稀释的待检样 品 (未知抗体 )0.1ml 于上述已包被之反应孔中 ,置 37孵育 1 小时 ,洗涤。 (同时做空白、阴性及阳性孔对照 ) 于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体 (抗抗体 )0
8、.1ml， 37孵育 30-60 分钟，洗涤 ,最后一遍用 DDW洗涤。 其余步骤同“双抗体夹心法”的 4、 5、 6。 （二） 酶与底物 酶结合物是酶与抗体或抗原 , 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是 ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。 免疫技术常用的酶及其底物 酶 底物 显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺 橘红色 492* 四甲替联苯胺 黄色 460* 氨基水杨酸 棕色 449 邻联苯甲胺 兰色 425 2,2-连胺基 -2(3-乙基 -并噻唑啉磺酸 -6)铵盐 蓝绿色 642 碱性磷酸酯酶
9、 4-硝基酚磷酸盐 (PNP) 黄色 400 萘酚 -AS-Mx 磷酸盐 +重氮盐 红色 500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖 黄色 405,420 葡萄糖 +甲硫酚嗪 +噻唑兰 深蓝色 -半乳糖苷酶 甲 基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 荧光 360,450 硝基酚半乳糖苷 (ONPG) 黄色 420 * 终止剂为 2mol/L H2SO4 * 终止剂为 2 mol/L 柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。 可催化下列反应： HRP+H2O2复合物 复合物 +AH2过氧化物酶 +H2O+A AH2 为无色底物 , 供氢体； A 为有色产物。 （三） ELISA 常用的四种方法 1 直接
10、法 测定抗原 将抗原吸附在载体表面； 加酶标抗体，形 成抗原 抗体复合物； 加底物。底物的降解量抗原量。 2 间接法 测定抗体 将抗原吸附于固相载体表面； 加抗体 , 形成抗原 -抗体复合物； 加酶标抗体； 加底物。 测定底物的降解量抗体量。 3 双抗体夹心法 测定抗原 将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面 ; 加抗原，形成抗原 -抗体复合物 ; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物 ; 加酶标抗抗体 (第二种动物抗体的抗体 ); 加底物。底物的降解量抗原量。 4. 竞争法 测定抗原 将抗体吸附在固相载体表面 ; (1) 加入酶标抗原； (2),(3)加入酶标抗原和待
11、测抗原； 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。 三仪器和材料 1. 聚苯乙烯微量细胞培养板 (平板 , 40, 96 孔 )。 2. 酶联免疫检测仪 3. 辣根过氧化物酶羊抗兔 IgG, 工作稀释度 1:1000。 4. 包被液 :： 0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液 ,4，保存 , Na2CO3 0.15 克 , NaHCO3 0.293 克 ,蒸馏水稀释至 100 ml。 5. 稀释液： 0.01mol/LpH7.4 PBS-Tween-20, ，保存 . NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween 20， 0.5m
12、l. 蒸馏水加至 1000ml。 6. 洗涤液：同稀释液 7. 封闭液： 0.5%鸡卵清蛋白， pH7.4 PBS。 8. 邻苯二胺溶液 (底物 )：临用前配制 0.1M 柠檬酸 (2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml, 蒸馏水 12.5ml, 邻苯二胺 10mg, 溶解后 , 临用前加 30%H2O2 40 微升。 9. 终止液： 2mol/LH2SO4。 四 . 操作步骤 1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释 , 一般为 1 10微克 /孔，每孔加200 微升， 37温育 1 小时后， 4冰箱放置 16 1
13、8 小时。 2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次， 最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 3. 加封闭液 200 微升， 37放置一小时。 4. 洗涤同 2。 5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释 ,，每孔 200 微升。同时作稀释液对照。 37放置 2小时。 6. 洗涤同 2。 7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔 IgG, 每孔 200 微升 , 放置 37 1 小时。 8. 洗涤同 2。 9. 加底物：邻苯二胺溶液加 200ml，室温暗处 10-15 分钟。 10. 加终止液：每孔 50 微升。 11. 观察结果：用酶联免 疫检测仪记录 490nm 读数。 更多 ELISA 试剂盒，请登入 http:/ 查询或邮箱 QQ:1193953234 电话： 0592-6020891 传真： 0592-6020771 厦门慧嘉生 物科技有限公司 欢迎与我们联系！
