1、实验七 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定改良赖氏法 一、实验目的了解丙氨酸氨基转移酶测定原理及方法。二、实验原理丙氨酸氨基转移酶（ALT）又称谷丙转氨酶（GPT）。它催化L丙氨酸和L谷氨酸之间氨基的转移，反应式为：丙酮酸与2，4二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙。此二硝基苯腙在强碱溶液中显红棕色，色泽深浅与产生的丙酮酸多少即酶活性成正比。三、仪器和试剂1仪器：37水浴恒温装置，试管和试管架，吸管，722型分光光度计。2试剂：0.0667 mol/L磷酸盐缓冲液。丙氨酸氨基转移酶基质液：称取DL丙氨酸1.78克，?酮戊二酸30毫克，先溶于0.0667 mol/L磷酸盐缓冲液约20毫升中，用1m
2、ol/L NaOH （约0.5毫升）调节pH至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100毫升。46中保存，并加一至二滴氯仿，防止细菌分解作用。 2,4-二硝基苯肼溶液： 溶2,4-二硝基苯肼200毫克于热1 mol/L HCl中，并用1 mol/L HCl加至1升刻度，避光保存。0.4 mol/L NaOH溶液。丙酮酸标准液（2mmol/L）：溶丙酮酸钠22毫克于缓冲液100毫升中，存放冰箱，此溶液在数天内是稳定的。四、实验步骤按下表加试剂（毫升）：加入物（ml） 测定管 测定空白管血清 0.10 加温至37的丙氨酸氨基转移酶基质液 0.50 0.50各管分别混和，置37水浴30分钟，取出。2，4二硝基
3、苯肼溶液 0.50 0.50血清 0.10各管分别混匀，置37水浴20分钟，取出。0.4 mol/L NaOH溶液 5.00 5.00在30分钟内用波长505nm比色，以蒸馏水校正零点和100%，读取各管吸光度。测定管吸光度减去测定空白管吸光度后，于标准曲线上查得酶活性单位。标准曲线绘制：（所加试剂按毫升计）加入物 （ml） 管 号1 2 3 4 5丙酮酸标准液（2mmol/L） 0 0.05 0.10 0.15 0.20丙氨酸氨基转移酶基质液 0.50 0.45 0.40 0.35 0.300.0667 mol/L磷酸盐缓冲液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10相当于丙酮酸实际
4、含量（?mol/L） 0 0.1 0.20 0.30 0.40相当于丙氨酸氨基转移酶活力（卡门氏单位） 0 28 57 97 150各管混匀后置37水浴5分钟，加2，4二硝基苯肼溶液0.5毫升混匀，置37水浴20分钟，取出，每管各加0.4 mol/L NaOH溶液5.0毫升，于30分钟内用波长505nm比色，以蒸馏水校正零点和100%，读取各管吸光度。以各管读数减去空白（第一管）读数后，以各管吸光度为纵坐标，以各管对应的单位数为横坐标作图，绘成标准曲线，两者应呈直线关系。不做标准曲线时，可做28卡门氏单位标准管，按下式计算结果：= 卡门氏单位五、参考值 丙氨酸氨基转移酶活力：528卡门氏单位六
5、、注意事项1、赖氏法校正曲线所定的单位是用比色法的实验结果和卡门分光光度法实验结果作对比后求得的，结果以卡门氏单位表示。卡门氏单位定义为：一定条件下，1ml血清能使A340值下降0.001的转氨酶活性定为1个卡门氏单位。实验证明97卡门氏单位以下的标本线性良好，但为了使用方便，将校正曲线延长至150卡门氏单位。2、血清ALT在室温（25）可以保存2天，在4冰箱中可保存1周，在-25可保存1个月。3、一般不需要每一份标本都作自身的对照管，以试剂空白管代替已能符合要求。但严重脂血症、黄疸及溶血血清可增加测定的吸光度；糖尿病酮症酸中毒病人血中因含有大量酮体，能与2，4二硝基苯肼作用呈色，因此，检测此类标本时，应作血清标本对照管。4、当血清标本酶活力超过150卡门氏单位时，应将血清用生理盐水稀释后重测，其结果乘以稀释倍数。5、加入2，4二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全。加入NaOH溶液的方法要一致，不同的方法也会导致吸光度读数的差异。6、底物中的?酮戊二酸和2，4二硝基苯肼均为呈色物质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015，如超出次范围，应检查试剂及仪器等方面的问题。
