1、 人血管生成素 II (Ang II)ELISA 试剂盒 使用规范 本试剂仅供研究使用 标本：血清或血浆 试验原理 ： Ang II 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ ELISA） .已知 Ang II 浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将 Ang II 和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的 HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物 A、 B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中 Ang II 的浓度呈比例关系。 试剂盒内容及其配制 试剂盒成份（ 2-8保存） 96 孔配置 48 孔配置 配制 96/48 人份酶标板
2、1 块板（ 96T） 半块板（ 48T） 即用型 塑料膜板盖 1 块 半块 即用型 标准品： 400pg/ml 1 瓶（ 0.6ml） 1 瓶（ 0.3ml） 按说明书进行稀稀 空白对照 1 瓶（ 1.0ml） 1 瓶（ 0.5ml） 即用型 标准品稀释缓冲液 1 瓶（ 5ml） 1 瓶（ 2.5ml） 即用型 生物素标记的抗 Ang II 抗体 1 瓶（ 6ml） 1 瓶（ 3.0ml） 即用型 亲和链酶素 -HRP 1 瓶（ 10ml） 1 瓶（ 5.0ml） 即用型 洗涤缓冲液 1 瓶（ 20ml） 1 瓶（ 10ml） 按说明书进行稀释 底物 A 1 瓶（ 6.0ml） 1 瓶（ 3.
3、0ml） 即用型 底物 B 1 瓶（ 6.0ml） 1 瓶（ 3.0ml） 即用型 终止液 1 瓶（ 6.0ml） 1 瓶（ 3.0ml） 即用型 自备材料 1 蒸馏水。 2 加样器： 5ul、 10ul、 50ul、 100ul、 200ul、 500ul、 1000ul。 3 振荡器及磁力搅拌器等。 安全性 1 避免直接接触终止液和底物 A、 B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。 2 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。 3 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。 操作注意事项 1 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。 2 实验中不用的板条应立即放回包装
4、袋中，密封保存，以免变质。 3 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。 4 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物 A、 B液时，避免使用带金属部分的加样器。 5 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。 6 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。 7 底物 A 应挥发，避免长时间打开盖子。底物 B 对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触 ，有毒。实验完成后应立即读取 OD 值。 8 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。 9 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
5、样品收集、处理及保存方法 1、 血清 -操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000 g 离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2、 血浆 -EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。 1000 g 离心 30 分钟去除颗粒。 3、 细胞上清液 -1000 g 离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。 4、 保存 -如果样品不立即使用，应将其分成小 部分 -70 保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在 37或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。 试剂的准备 1 标准品：标准品的
6、系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行： 400 pg/ml （ 6 号标准品） 原倍浓度不用稀释直接加入 50ul。 200 pg/ml （ 5 号标准品） 100ul 的原倍标准品加入 100ul 的标准品稀释液 100 pg/ml （ 4 号标准品） 100ul 的 5 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液 50 pg/ml （ 3 号标准品） 100ul 的 4 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液 25 pg/ml （ 2 号标准品） 100ul 的 3 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液 12.5 pg/ml （ 1 号标准品）
7、 100ul 的 2 号标准品加入 100ul 的标准品稀释液 0 pg/ml （空白对照） 原始浓度不用稀释直接加入 50ul。 2. 洗涤缓冲液（ 50）的稀释：蒸馏水 50 倍稀释。 操作步骤 1 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡 ，产生加样上的误差。 2 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。 3 加入稀释好后的标准品 50ul 于反应孔、加入待测样品 50ul 于反应孔内。立即加入 50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀， 37温育
8、1 小时。 4 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3 次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 5 每孔加入 80ul 的亲和链酶素 -HRP，轻轻振荡混匀， 37温育 30 分钟。 6 甩去孔内液 体，每孔加满洗涤液，振荡 30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作 3 次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 7 每孔加入底物 A、 B各 50ul，轻轻振荡混匀， 37温育 10 分钟。避免光照。 8 取出酶标板，迅速加入 50ul 终止液，加入终止液后应立即测定结果。 9 在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。 建议使用的实验方
9、案 标准品浓度（ pg/ml） A 400 400 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 B 200 200 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 C 100 100 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 D 50 50 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 E 25 25 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 F 12.5 12.5 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 G 0 0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 H 样品 样品 样品
10、 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 局限 6 号标准品以上的结果为非线性的， 根据此标准曲线无法得到精确的结果。 试剂盒性能 1. 灵敏度：最小的检测浓度小于 1 号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990。 2. 特异性：不与其它细胞因子反应。 3. 重复性：板内、板间变异系数均小于 10%。 结 果 判 断 与 分 析 1、仪器值：于波长 450nm 的酶标仪上读取各孔的 OD 值 2、以吸光度 OD 值为纵坐标（ Y），相应的 Ang II 标准品浓度为横坐标（ X），做得相应的曲线，样品的 Ang II 含量可根据其 OD 值由标准曲线换算出相应的浓度。 3、 检测值范围： 0-400pg/ml 4、敏感度： 1.0 pg/ml
