1、实验2 分离以尿素为氮源的微生物,脲，又称尿素，,是蛋白质的降解产物，会污染环境，但可以被含脲酶的微生物分解。,实验原理：,含有脲酶的细菌可以从尿素中得到N源，而其他细菌不能得到N源，因此可以用以尿素为唯一N源的培养基选择出这些微生物。,尿素在脲酶的降解下产生NH3，使培养基的PH变为碱性，酚红遇碱由红黄色变成红色，因此可以用酚红鉴定。,选择培养基,LB全营养培养基,尿素为唯一氮源的培养基,土壤稀释液（多种微生物）,结果如何？,设备及用品：实验材料：(1)25mL全营养LB固体培养基：蛋白胨0.25g、酵母提取物0.12g、NaCl0.25g、琼脂糖0.5g、加水25mL。(2)25mL尿素固
2、体培养基：0.025g葡萄糖、NaCl 0.12g、K2HPO40.12g、酚红0.25mg、琼脂糖0.5g、加水15mL。灭菌冷却到60时加入经G6玻璃漏斗过滤（使其无菌）的尿素溶液（内含2g脲）10mL。3）土样1g。,,1. 酚红的作用是什么？2. 凝固剂为什么使用琼脂糖，而不是琼脂？3. 能否连同尿素一起进行灭菌？如何操作？,实验步骤：,观察,注意：尿素经过G6玻璃漏斗过滤后加入,培养基的配制和灭菌,倒平板,接种,全营养LB固体培养基（对照组）,尿素固体培养基（实验组）,玻璃刮刀、涂布分离,培养,对照组：实验组：,制备细菌悬液,倒置，37恒温培养箱，24-48h左右,菌落数量和种类多而
3、杂,菌落少、单一，菌落周围出现红色区域,制备细菌悬液：,99ml的无菌水,4.5ml的无菌水,1g土壤,-4,-4,-4,-5,-5,-5,1g土样,99ml无菌水,-3,-4,-5,微量移液器的使用,LB培养基上10-6 、10-7稀释液涂布结果,尿素培养基上10-4 、10-5稀释液涂布结果,37恒温培养,注意事项为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般取三个稀释度,同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,微生物的培养与观察,稀释涂布平板法可用于测定活菌数：,每克样品中的菌
4、落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,例如 若某同学将10毫升的菌液稀释成10-7倍，涂布分离后，3个平板的菌数依次为：20个，22个，18个。请问，你能算出该试管中的细菌数大约是多少吗？,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),例：根据分离以尿素为氮源的微生物实验，回答下列问题：写出脲酶降解尿素的反应式
5、_；该实验分离细菌时用浓度为10-4和10-5土壤稀释接种，更容易形成单菌落的_.A同学筛选出的菌落为150个，其他同学只选择出50个，并且他在设计实验时并没有设置对照。你认为A同学结果产生的原因可能有哪些?_如何设计对照实验排除可能影响实验结果的因素：_涂布平板的所有操作怎样保证无菌？,(NH2) 2C=O+H2O 2NH3+CO2,脲酶,10-5土壤稀释,可能是土样不同，也可能是培养基污染或操作失误,一是由其他同学用与A同学一样的土壤进行实验，如果与A同学一致则证明无误。如果不同，则证明A同学存在操作或培养基配制配制有问题。,二是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,从操作的各个细节保证“无菌”，都应在火焰旁进行。,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,颜色：,预期： 酚红由黄变红。说明有分解尿素的细菌存在，且随着培养时间的延长，红色区域的面积越来越大。,中性,碱性,细菌,黄色 红色,酚红：酸碱指示剂，变色范围：pH6.48.2,
