1、生化大实验,实验课程简介,生化大实验是一门综合性的实验课程，教学的目的在于通过对生命物质的分离制备，纯化，分析等综合性实验，在已掌握的基础生物化学理论知识和生化实验常用方法的基本原理、基本操作技术（如滴定、比色、层析、电泳等）的基础上，训练学生的综合实践动手能力，掌握蛋白质、酶、核酸等重要物质的分离、纯化等的测定技术。,目 录,实验一 蛋白质含量的测定实验二 离子交换法血清纯化IgG实验三 离子交换层析法分离血清白蛋白实验四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量实验五 等电聚焦法测定样品的等电点实验六 质粒的分离与纯化实验七 PCR扩增目的基因片段实验八 酶联免疫吸附实验,实验一 蛋白质含量的
2、测定,（一）考马斯亮蓝法,【实验目的】 学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。【实验原理】 考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质-染料结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。,考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色形式，红色-棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色-棕黑色和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，测定595 nm吸光的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。 蛋白质与染料结合速度很快，2min就可以反应完全，并可以稳定1h，蛋白质-染料复合物有很大的消光系数，使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为10-100g蛋白质，微量测定时达到1-10g蛋白质
3、。此反应反复性好精度高，线性关系好。,【实验仪器及用品】,1. 标准蛋白液（0.1mg/ml）0.2g结晶牛血清白蛋白用0.9%NaCl 稀释到2000ml。 2. 0.9%NaCl 3. 考马斯亮蓝试剂：100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 5%乙醇中，加100ml85%磷酸，蒸馏水稀释1000ml，滤纸过滤。 4. 待测蛋白：人血清，用前用0.9%NaCl稀释200倍。 5. 漩涡混合器,6. 移液管0.5ml（2），1.0ml（2）， 5ml（1）7. 分光光度计8. 试管1.5cm15cm (8)9. 量筒100ml(1)10. 电子分析天平11. 试管架(1),【实验内容及步骤】
4、,一、标准曲线线的绘制 取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。 以A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准曲线。,2. 未知样液的测定 另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。【注意事项】 1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内测定吸光度，在这段时间内样色很稳定。 2、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿上，实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。,【思考题】,1、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白质浓度。 （1）样品不容易溶解，但
5、要求结果很准确。 （2）要求在半天内测定60个样品。 （3）要求很迅速的测定一系列试管（30只）中溶液的蛋白质浓度。 2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。,二、紫外分光光度法测定蛋白质含量,【实验目的】 1. 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 2. 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术和使用方法。【实验原理】 蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，因此可作蛋白质定量分析。,利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干
6、扰测定，因此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是：对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定误差。2若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干扰，此时必须同时测定260和280nm吸光度，通过公式校正测定，以消除核酸的影响，而推算处蛋白质浓度。 不同蛋白质和核酸吸收是不同的，即使校正也存在误差，但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的浓度范围为0.11.0mg/mL。,【仪器与试剂】 1. 紫外分光光度计，比色管（10ml的5个），吸量管。 2. 标准蛋白质溶液：0.9%NaCl溶液溶解0.25g结晶牛血清白蛋白，稀释到250ml。 3. 待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓度在1.0-2.5
7、mg/ml 4. 0.9%NaCl溶液 5. 试管1.5cm15cm（9） 6. 移液管1ml（3），2ml（2），5ml（2）。,【实验步骤】 1、标准曲线法 （1）标准曲线的制作：取8只试管按表2-5加入试剂，摇匀。选择光程1cm 石英比色皿，在280nm波长测定A280，以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。,表1-2 紫外分光光度法测定蛋白质浓度-标准曲线的绘制,（2）样品测定： 配制待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。 2. 直接测定法 在紫外分光光度计上，将待测蛋白质溶液加入比色皿，以生理盐水为对照，测定280n
8、m和260nm波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260 (C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)。,本法适用于微量蛋白质浓度测定，对盐类混杂的情况比较合适，为简便起见，对混合蛋白质溶液，可用A2800.75来表示蛋白质大概浓度。【注意事项】 由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，显色深浅随不同蛋白质改变，因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，尽管进行了公式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，致使280nm紫外吸收法检测的准确性较差。【思考题】 1
9、.紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么？ 2. 影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些？,三、Folin-酚法测定蛋白质浓度,【实验目的】 熟悉Folin-酚法测定蛋白质浓度的方法。【实验原理】 Folin-酚法又称lowry法。首先在碱性溶液中形成铜-蛋白质复合物，后与磷钼酸-磷钨酸作用，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝复合物，这中复合物在750nm和660nm处有最大吸收峰，颜色与蛋白质浓度成正比，进而可以计算蛋白质浓度。,【材料、试剂、与器具】,1. Folin-酚A（碱性铜试剂）：20g碳酸氢钠和4g氢氧化钠双蒸水定容1000ml为储备液1；0.5g五水硫酸铜1g Na3C6H5O7，定容
10、100ml，为储备液2。 将50ml储备液1和1ml储备液2混合为溶液A,混合后一日有效。 2. Folin-酚B：100g钨酸钠、25g钼酸钠、100g 蒸馏水、50ml80%磷酸、100ml浓硫酸在1500ml磨口圆底小瓶中混匀后接上磨口冷凝管，回流10h再加入硫酸锂150g、蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15min，冷却，稀释至100ml过滤，至微绿，储存于棕色瓶。临用前氢氧化钠滴定，用酚酞做指示剂，据滴定结果，将试剂稀释至1mol/L的酸，冰箱保存。,3、标准浓度牛血清蛋白溶液200g/ ml4、721分光光度计5、刻度吸管0.5ml（1），1ml（2），5ml（1）6、试管1.5
11、cmX15cm8只7、恒温水浴【操作步骤】1、标准曲线的绘制,取6只试管，按下表加入试剂:,加入试剂A后，混匀，室温10min，在加Folin-酚B 3.0ml，混匀后10min，再第二次加0.2ml，混匀放置30min。于660nm比色，做标准曲线。 2、样品测定 取样品1ml按上表加试剂，660nm处比色，对照标准曲线求出蛋白质浓度。【思考题】 1、Folin-酚法测定蛋白质浓度的原理是什么？ 2、影响Folin-酚法测定蛋白质浓度的准确性的因素有那些？,四、双缩脲法,【实验目的】 了解双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。 【原理】 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中
12、蛋白质与C u2形成紫红色络合物，在540nm波长处有最大吸收。在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法定量测定 双缩脲法通常用于需要快速但不十分精确的测定。,【试 剂 和 器 材】 1. 2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液 2. 容量瓶10ml（6） 3. 试管1.5cm15cm（8） 4. 双缩脲试剂：溶解0.175g硫酸铜（CuSO4 5H2O）溶于15ml水中，在100ml容量瓶中加入30ml 浓氨水、30ml冷蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠，摇匀，室温1-2h定容100ml，摇匀备用。在搅拌下加入300ml10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存在内壁涂以
13、石腊的瓶中。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。,5. 吸量管（1ml，2ml，5ml） 6. 721型分光光度计【操作步骤】 1. 绘制标准曲线 取6只试管编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液。 另取试管7只，按0、1、2、3、4、5、6编号，1-6号分别加上述蛋白质溶液3.0ml0号为对照，加3.0ml 蒸馏水分别加入，各试管中加双缩脲试剂 2.0 ml混匀，紫色出现后，与540nm测定吸光度，闭塞测定法务必在30min内完成，绘制蛋白质浓度吸光度曲线。,2. 未知样品蛋白质浓度的测定 取样品3.0ml于试管中，加双缩脲试剂2.0ml混匀，于540nm
14、处测定其吸光度，对照标准曲线，求出蛋白质浓度。【思考题】 1. 本法与其他测定蛋白质浓度的方法比较，有那些优点？ 2. 若样品中有干扰测定的杂质，应该如何校正实验结果？,实验二 离子交换法血清纯化IgG,【实验原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基 - 乙基 - 葡萄糖凝胶 A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。用 NaOH 将 Cl - 型转变为 OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的 球蛋白属于中性蛋白（等电点为 pH6.85 7.5 ），其余均属酸性蛋白。 pH 7.2 7.4 的环境中。酸性蛋白均被 DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有 球蛋白便可在洗脱液中
15、先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的 IgG 。,【试剂与器材】,1. DEAE-Sephadex A-50 2. 0.5mol/L HCl 和 NaOH 3. 0.1mol/L pH7.4 PBS 4. 0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 5. 0.02 NaN 3 6. PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9. 1cm20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器,【操作步骤】,1 DEAE-Sephadex A-50 预处理 称 DEAE-Sephadex A-50 （下称 A-50 ） 5g ，悬于 500ml 蒸馏水内， 1h 后倾去上层细粒
16、。按每克 A-50 加 0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于 0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置 30min ，装入布氏漏斗（垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至 pH 呈中性；再以 0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以 0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将 A-50 浸泡于 0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。,2 装柱,（ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 （ 2 ）将 0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至 1/4 高度，再倒
17、入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的 A-50 。待 A-50 凝胶沉降 2 3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速 1ml/min ，同时连续倒入糊状 A-50 凝胶至所需高度。 （ 3 ）关闭出水口，待 A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。,3 平衡 启开出水口螺旋夹，控制流速 4 滴 /min ，使约 2 倍床体积的洗脱液流出。并以 pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之 PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。 4 加样及洗脱 启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当
18、柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（ 0.5ml 血清，体积应小于床体积的 2% ，蛋白浓度以 100mg 为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁 2 3 次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速， 4 滴 /min.,5 收集 开始洗脱的同时就以试管进行收集；每管收集 4ml. 共收集 10 15 管。 6 测蛋白 以 751 型紫外分光光度计分别测定每管 A 260 ，按公式计算各管蛋白含量。并以 A 280 为纵坐标，绘制洗脱曲
19、线。 7 合并、浓缩 将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以 PEG （ Mw6000 ）浓缩至所需体积，加入 0.02 NaN 3 防腐，于 4 保存备用。长期保存时应贮于 -40 冰箱。 8 A-50 凝胶的再生 在柱上先以 2mol/L NaCl 洗脱杂蛋白至流出液的 A 280 0.02 ，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将 A-50 再处理一遍即达再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中 4 保存；近期不用时，以无水酒精洗 2 次，再置 50 温箱烘干，装瓶内保存。,实验三 离子交换层析法分离血清白蛋白,【实验目的】 通过对白蛋白纯化的实验，培养学生综合运用离子交换层析手段分
20、离蛋白质纯品的技能。,【基本原理】 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH 的溶液中解离，而后流经固定相，使之与固定相上的可解离基团进行离子交换，吸附于固定相上，凡不能进行交换吸附的成分，则流出层析柱外。,再根据交换吸附于固定相的各组分解离力度的差别，运用不同的pH值或不同盐浓度的溶液作流动相，流过层析柱将各组分分别再交换洗脱下来，这样混合物的各组分即被分开，达到分离的目的，此即为离子交换层析。,【试剂与器材】,1. 20%磺酰水杨酸2. DEAE32cellulose3. PBS（0.0175M pH6.7）：取0.2M Na2H
21、PO4 3.5mL、0.2M NaH2PO4 56.5ml混合，用酸度计检查pH值应为6.7。取该混合液87.5ml用蒸馏水稀释至1000mL。4. 0. 1N HCl和0.1N NaOH5. Nessler试剂6. 1cm20cm层析柱7. 黑、白比色板,【操作步骤】,1. DEAE32纤维素的活化处理： (1)取DEAE32纤维素1.5g（DEAE32纤维素的量（干重），一般按样品的蛋白质量计算，大约是蛋白质量的1015倍）悬于0.1N NaOH溶液中，浸泡过夜，用300ml锥形瓶盛装； (2)次日，在布氏漏斗上轻吸过滤，用蒸馏水洗，直至pH.8.0左右，抽干；(3)用0.1N HCl浸泡
22、30min，用蒸馏水洗净，直至pH.6.0左右，抽干；,(4)PBS（0.0175M pH6.7）浸泡3hr； (5)倾去微细颗粒（浮悬），加入PBS（0.0175M pH6.7）使容积为沉淀体积的1.5倍； 2. 关闭柱的出口，向柱内加入1/3体积的PBS （0.0175M pH6.7）,将DEAE32cellulose悬浮液 用玻棒引流连续倒入柱内，当交换剂沉积到底部时，打开流出口，让缓冲液缓慢流出，再倒入更多的悬液，直至整个用量加完为止； 3. 将柱与储液瓶（内盛同样PBS）连接，流洗几个柱体积的缓冲液，使柱床稳定，并使得流出液pH为6.7；,4. 纯化-球蛋白：取实验3所保存溶液（-球
23、蛋白），再对PBS（0.0175M pH6.7）透析12-24hr，更换数次PBS，使蛋白质溶液中pH为6.7； 5. 将透析后的粗提IgG样品缓缓加在柱床顶部，打开出水口，待样品全部进入柱床后，缓慢流入PBS（0.0175M pH6.7），调整流速至0.3ml/min，开始用Eppendorf管收集洗脱液，每管1ml，先用磺酰水杨酸检测有无蛋白质流出（蛋白质遇磺酰水杨酸显白色，故用黑色比色板），待蛋白质流出后，迅速收集蛋白液（视收集量和蛋白质的浓度可选择用30%PEG浓缩）。此不被吸附的即为纯化的-球蛋白；,6. 将收集到的蛋白液合并，紫外分光光度计法(见实验1)测定蛋白质的含量，取部分溶液
24、进行纯度鉴定、分子量和等电点的测定实验； 7. 用完的凝胶柱用1M NaCl流洗干净，再用0.02M NH4Ac缓冲液（pH6.5）流洗平衡后可重复使用，但应将顶部吸去并新添，暂不用时可将其倒出，浸于1%正丁醇的缓冲液中，以防霉变。,8. 纯化白蛋白 取上一实验所保存溶液（白蛋白）, 再对PBS（0.0175M pH6.7）透析24hr，更换数次PBS，使蛋白质溶液中pH为6.7；透析后白蛋白样品上柱后，改用 0.06 mol/L NH4Ac 缓冲液（pH6.5）洗涤，流出约 30 ml（其中含及球蛋白）后，将柱上的缓冲液面降至与纤维素床表面平齐。然后改用0.3 mol/L NH4Ac 缓冲液
25、 （pH6.5）洗脱，并用20%磺基水杨酸检查流出液是否含有蛋白质。由于纯化的白蛋白仍然结合有少量胆色素等物质，故肉眼可,见一层浅黄色的成分被0.3 mol/L NH4Ac 缓冲液洗脱下来，大约改用 0.3 mol/L NH4Ac 洗脱约 4 ml时，即可试出有蛋白质白色混浊，立即连续收集3管，每管10滴，此即为纯化的白蛋白液，取其中蛋白质浓度高的两管留作含量测定和纯度鉴定用（视收集量和蛋白质的浓度可选择用30%PEG浓缩）。用过的DEAEcellulose层析柱，应重新再生平衡，方法如下，先用20 ml 1.5 mol/L NaCl 0.3 mol/L NH4Ac流洗，再用 40 ml 0.
26、02 mol/L NH4Ac（pH6.5）流洗平衡即可。暂不用时可将其倒出，浸于1%正丁醇的缓冲液中，以防霉变。,【注意事项】 1. 装柱时柱子一定要垂直； 2. 装柱时应注意，柱床内不得产生界面、气泡，表面要平整； 3. 柱子用完后一定要用高浓度的盐溶液洗净。,实验四 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳测定蛋白质分子量,【实验目的】1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。2.掌握垂直板电泳的操作方法。3.运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。,【基本原理】,聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白组分的分子大小和形状以及所带电荷
27、多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。将已知相对分子质量的标准蛋白的迁移率对分子量的对数作图，可得到一条标准曲线。将未知相对分子量的蛋白质样品，在相同的条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率可在标准曲线上查得它的相对分子量。也可以用相关分析软件得出回归方程并计算出结果。,【仪器、材料与试剂】（一）仪器 1. 电泳仪 2垂直平板电泳槽 3微量进样器（二）材料 1. IgG： 2.血清,（三）试剂 1. 凝胶贮液：丙稀酰胺（Acr）30g、双丙稀酰胺（Bis）0.8g，ddH2O溶解，定容至100ml。 2. 0.05M pH8.0 Tris-HCl缓冲液：0.61 gTris加入 50ml ddH2O
28、使之溶解，再加入3ml 1M HCl溶液，混匀后在pH计上调pH至8.0，最后加ddH2O定容至100ml。 3. 分离胶缓冲液：Tris 36.3g加入1M HCl溶液48.0ml，再加ddH2O到100ml，pH8.9。,4. 电极缓冲液：3 g Tris、14.4 g甘氨酸、1g SDS，ddH2O定容至1000ml。 5. 样品缓冲液：1.0ml甘油、0.1ml巯基乙醇、100mgSDS、2mg溴酚蓝、2ml Tris-HCl （pH8.0） 缓冲液，ddH2O定容至10ml。 6. 过硫酸铵（AP）溶液：1gAP溶于10ml ddH2O中（要求现用现配）。 7. 四甲基乙二铵（TEM
29、ED）。,8. 染色液：1.25 g 考马斯亮兰 R-250，溶于500ml固定液中，混匀。 9. 脱染液：75mL冰醋酸、50mL甲醇、875ml水，混匀。 10. 标准蛋白（次高分子量）。 11. 浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g加1M HCl 溶液48.0ml，加ddH2O到100ml，pH6.7。 12. 固定液：取50%甲醇454mL，冰醋酸46ml混匀。,【实验步骤】 1. 将电泳槽玻璃板洗净，吹干，安装好；用1%的琼脂糖电泳缓冲液（1g琼脂糖溶于100ml电泳缓冲液）封严玻璃板的边和底（保证不漏胶/新式电泳槽此步免）； 2. 配分离胶（2.5mlTris（pH8.9）3.3ml
30、凝胶溶液4.2ml蒸馏水，50l-10%SDS溶解，混匀后再加入50l AP和10l TEMED，混匀）; 3. 将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶槽高三分之二处，加12cm高的蒸馏水密封。待胶凝固后（约需30min）倒掉水，用吸水纸吸干；,配浓缩胶（1.25mlTris（pH6.7）0.85ml凝胶溶液2.95ml蒸馏水，20l-10%SDS溶解，混匀后再加入25l AP和10l TEMED，混匀），将配好的浓缩胶立即倒入凝胶槽（插入梳子不溢出为宜），插入梳子；,对于不同分子量样品建议使用的凝胶浓度,4. 待胶凝固后，拔出梳子，加入电泳缓冲液（淹没胶，但不高于电泳槽）； 5. 样品处理：
31、取标准蛋白或样品10-20l，加入10-20l样品缓冲液，混匀，100水浴加热35min。 6. 进样：将处理好的样品10l加入到凝胶孔中，连接电泳仪； 7. 电泳：打开电源，调整电压至100V，开始电泳，待样品全部进入凝胶后，将电压调至120V，待指示剂（溴酚兰）到达凝胶的底部,距离下缘1cm时停止电泳，取下玻璃板，小心地把其中一块玻璃板从凝胶上取下来，测量分离胶的长度及分离胶上沿至溴酚蓝带中心的距离，记录于表中，或者在溴酚蓝带的中心插入一段细铜丝以标出染料的位置，取出分离胶（注意保持胶的完整性）； 8. 固定：将胶置于固定液中浸泡30min； 9. 染色：将分离胶浸入染色液中染色30min
32、；,10. 脱染：取出分离胶，先用蒸馏水漂洗一次，浸入脱染液中脱染，室温浸泡凝胶或37加热使其脱色，更换几次脱色液，直至出现清晰的电泳带为止； 11. 将胶片小心放置于一块玻璃板上，分别测量分离胶的长度、样品和标准蛋白的泳动距离（分离胶上沿至各蛋白区带中线的距离）； 12. 凝胶照相；,13、电泳迁移率的计算 （1）不插铜丝的计算方法：迁移率=（蛋白质移动距离 / 染料移动距离）（染色前胶长 / 脱色后胶长） （2）插铜丝的计算方法：迁移率= 蛋白质移动距离 / 染料移动距离,14、标准曲线的制作：以各标准蛋白质样品迁移率做横坐标，蛋白质分子量作纵坐标，在半对数坐标纸上作图，即可得一条标准曲线
33、（也可取蛋白质分子量的对数值用一般坐标纸作图）。测得待测蛋白质的迁移率后，由曲线上即可查出其分子量。,【注意事项】 1 丙烯酰胺具有中等毒性.常人每天允许的最大暴露量不超过0.5g/kg,皮肤接触可致中毒,症状为红斑,脱皮,眩晕,动作机能失调,四肢无力等. 2没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近，一定要催化充分,使之完全聚合，集中处理,实验中全部的胶由专门受过训练的人收集到一起,在一个特殊标明的容器中保存,并进一步催化使之反应完全,最后送交学校危险品仓库,统一处理. 3待测样品如果蛋白含量低于1mg/mL，处理之前应先浓缩至1mg/mL；若高于1mg/mL，处理之前应先稀释至1mg/mL。,【
34、思考题】 1. 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 2. 电极缓冲液中甘氨酸的作用? 3. 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 4. 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?,实验五 等点聚焦测定蛋白质的等电点,【实验目的】 1. 掌握凝胶等电聚焦的基本原理。 2. 学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法。,【实验原理】,蛋白质（酶）、多肽等两性电解质，其所带电荷的数量与性质，随所处环境的pH而变化。环境pH低于其等电点时，带正电荷，在电场中向阴极移动；环境pH高于其等电点时，带负电荷，在电场中向
35、阳极移动；环境pH等于其等电点时，不带电荷，在电场中不移动。据此，在电泳系统中创造一个由阳极向阴极，pH由低到高的连续而稳定pH梯度环境，那么处在这种系统中具有不同等电点的各种蛋白质，将根据所处环境的pH与其自身等电点的差异，分别带上正电荷或负电荷，并向与它们各自的等电点相当的pH环境位置处移动，当到达该位置时即停止移动，从而各自焦聚（聚焦），分别形成一条集中的蛋白质区带。这种根据蛋白质等电点的不同而将它们分开的电泳方法称为等电聚焦电泳。电泳后测定其各种蛋白质“聚焦”部位的pH，即可得知它们的等电点。,（一）仪器 1. 电泳仪 2垂直平板电泳槽(园盘电泳)（二）材料 1. IgG： 2. 血清
36、（三）试剂 1. 两性电解质Ampholine，pH 310，浓度40%。 2. 丙烯酰胺（Acr）溶液：Acr 30g ，甲叉双丙烯酰胺（Bis）1.0g，蒸馏水溶解后定容至100ml，过滤，4保存。,3. TEMED410% AP溶液：临用时配制。5正极缓冲液：0.2%(V/V)硫酸或磷酸。(85%磷酸29.4ml配成500ml)6负极缓冲液：0.5%(V/V)乙二胺水溶液。(NaOH10g配成500ml)7固定液：10%(W/V)三氯乙酸。8染色液：考马斯亮蓝R250 2.0 g以50%甲醇 1000ml溶解。使用时取93ml，加入7.0ml冰醋酸，摇匀即可使用。9脱色液：按5份甲醇、5
37、份水和1份冰醋酸混合即可。,【实验步骤】,凝胶制备：按下表配制7.5 %凝胶。 水：7.0ml 30%凝胶储液：2.5ml Ampholine：0.3ml 蛋白质样品：0.1ml AP（10%）：0.05ml TEMED：0.01ml,吸取丙烯酰胺凝胶储液，AP和水于50ml的小烧杯中混匀，在真空干燥器中抽气10min（本实验将次步省略，并不影响实验结果）。然后加入0.3ml Ampholine、0.1ml IgG待测样品和0.01ml TEMED溶液，混匀后立即制胶（方法同SDS-PAGE电泳），胶液加至距离顶部5mm处，在胶面上覆盖3mm厚的水，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置203
38、0min即可聚合。为观察聚焦状况，可在样品中加入聚焦指示剂，如带红颜色的肌红蛋白（PI=6.7）、细胞色素C（PI=10.25）或甲基红染料（PI=3.75），以示聚焦的进展情况。,2. 电泳：吸去凝胶表面上的水层，于电泳槽正极缓冲液加入0.2%的硫酸（或磷酸），负极加入0.5%的乙二胺（或乙醇胺/或NaOH）。打开电源，将电压恒定为160V，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，停止电泳。 3. 剥胶：电泳结束后，取下胶块，分别于正负两极做上标记，切不可弄混，并测量出凝胶的长度。,4. 固定、染色和脱色：固定液
39、中浸泡30min ，然后转移至脱色液中浸泡，换3次溶液，每次10min浸泡过程中不断摇动，以除去Ampholine。量取并记录漂洗后的胶长。再把胶放置于染色液中，室温染色30min，取出用蒸馏水洗后，放在脱色液中脱色，不断摇动，并更换35次脱色液，待本底颜色脱去，蛋白质区带清晰时，量取并记录凝胶长度以及蛋白质区带中心至正极端的距离。,5. pH梯度的测量：在未固定前将凝胶纵切为两部分，一部分用于进行第四步，另一部分（三条泳道即可）按从正极端向负极端的顺序切成0.5cm的区段，按次序放入有标号的、装有1ml蒸馏水的试管中，浸泡过夜，然后用精密pH试纸测出每管浸泡液的pH并记录。有条件的实验室最好
40、用精密pH计测定。,6、结果测定： （1）pH梯度曲线的制作：以胶长（mm）为横坐标，各区段对应的pH的平均值为纵坐标，在坐标纸上作图，可得到一条近似直线的PH梯度曲线。由于测得的每一管的pH是5mm长一段凝胶各点pH的平均值，因此作图时可把此pH视为5mm小段中心区的pH，于是第一小段的pH所对应的凝胶长度为2.5mm；第二小段的PH所对应的凝胶长度为（522.5）mm；由此类推，第n小段的PH所对应的凝胶长度为（5n2.5） mm。,（2）待测蛋白样品等电点的计算： 按下列公式计算蛋白质聚焦部位距凝胶正极端的实际长度（Lp表示）： Lp=lpl1 / l2式中 lp染色后蛋白质区带中心至凝
41、胶正极端的长度l1凝胶固定前的长度l2凝胶染色后的长度 根据上式计算待测蛋白的Lp，在标准曲线上查出所对应的pH，即为该蛋白的等电点。,【注意事项】 1. 盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲。为防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。 2. 加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250染色，加样量可为50-150g；如用银染色，加样量可减少到1g。一般样品浓度以0.5-3 mg/mL为宜，最适当加样体积为10-30l。,3. 通常，窄范围的p
42、H梯度可以提高分辨率，但是需要时间也比较常，pH梯度范围为2是较好的选择。 4. 由于电源和凝胶冷却系统的限制，最长的凝胶长度为810cm，实际上，分别电泳几块不同的pH梯度的凝胶比只电泳一块较长凝胶效果更好。 5. 在变性液中加入2Triton X100以保证蛋白质（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推荐使用如CHAPS和Zwittergent314等两性离子去垢剂。,【思考题】,1凝胶等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点的原理？ 2. 凝胶等电聚焦电泳法操作时应注意的问题？,实验六 质粒的分离与纯化,【实验目的】 通过本实验学习和掌握碱裂解法分离提取质粒。,【实验原理】,碱裂解法去、提取质粒是根
43、据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它 们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性 的DNA双螺旋结构解开而被变形，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘旋，仍会紧密地结合在一起。当加入ph4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。,【仪器、材料与试剂】,（一）仪器 恒温培养箱；恒温摇床；台式离心机；高压灭菌锅（二）材料 1. 葡萄糖
44、2. 三羟甲基氨基甲烷 3. 已二胺四乙酸 4. 氢氧化钠,5. 十二烷基硫酸钠6. 乙酸钾7. 冰乙酸8. 氯仿9. 乙醇10. 胰RNA酶11. 氨苄青霉素12. 蔗糖,13. 溴酚蓝14. 酚15. 8-羟基喹啉16. 巯基乙醇17盐酸18. puC19质粒的大肠杆菌20. 吸头、小指管,（三）试剂 1. 溶液 50mmol/l 葡萄糖 25mmol/l 三羟甲基氨基甲烷 10mmol/l乙二胺四乙酸 2. 溶液 0.4mol/l 氢氧化钠，2%SDS用前等体积混合 3. 溶液,5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 4. TE缓冲液 10mmol/L Tris.Hcl(PH8.0) 1mmol/L Edta(PH8.0) 5. 70%乙醇 6. 胰RNA酶 将RNA酶溶于10mmol/L Tris.Hcl、15mmpl/L氯化钠中，配成10mg/mL的浓度，于100摄氏度加热15分钟，缓慢冷却至室温，保存于-20摄氏度。 7. 凝胶加样缓冲液(6x)：40%蔗糖、0.25%溴酚蓝 8. 酚,
