1、典型发酵产品介绍,传统发酵产品,一、酒,压榨酒包括黄酒，啤酒，葡萄酒。压榨酒酒精含量比较低。蒸馏酒主要指白酒。蒸馏酒的酒精含量高，浓度越高质量越高，高档的白酒酒精含量一般大于50。,酒分白酒、黄酒、啤酒、葡萄酒。,按颜色，分为有色酒和无色酒。,按本质分，有压榨酒和蒸馏酒。,浸米蒸饭淋饭摊冷加酒药（菌种）发酵（缸中5-7d）装坛低温发酵压榨煮酒（灭菌）装坛泥封堆置陈化（后熟）出厂,1、黄酒,我国的民族特产和传统食品，也是世界上最古老的饮料酒之一。以谷物为主要原料，利用酒药、麦曲或米曲所含的多种微生物的共同作用酿制而成的发酵原酒。长江以南地区，主要分布在浙江、江苏、福建，以稻米为原料。长江以北地区
2、，主要以小米为原料。,制作过程,按生产方法 按成品酒的含糖量,黄酒的分类,传统工艺黄酒新工艺黄酒,干型黄酒 糖含量20.00,以纯种发酵取代自然发酵，以大型发酵生产代替小型手工操作，生产过程简化，原料利用率高，去除了笨重的体力劳动,以酒药、麦曲或米曲、红曲及淋饭酒母为糖化发酵剂，进行自然的、多菌种的混合发酵生产而成，发酵周期长,淋饭酒摊饭酒喂饭酒,1状元红 2加饭酒3善酿4香雪5花雕,A.绍兴黄酒,压榨后加上酱色（糖炒焦和小苏打混合，加入），酒精浓度为10%-20%。,蒸饭分批加入，保持高浓度的培养基，高浓度发酵。,进一步提高酒精度，用状元酒代替水冲缸，装坛。,黄酒蒸馏，酒浓度高。,雕花的缸装
3、的状元红。,江阴黑酒（木酒），米煮熟后炒焦，用木头装坛；闽南，沉缸酒；厦门，红曲黄酒（加入红曲霉）。,B.其他几种有特色的酒,属于甜型水酒。酒药为黄曲霉，根霉。酒母：糯米加麦曲，加酒药，浸泡晾干。精米率：70-75，而一般黄酒88-92。后处理：经压滤、澄清后，还需进行过滤、调配，60-65灭菌后储存一年，出库时再次进行调配、过滤，并用活性炭脱色，最后加热至65 ，趁热装瓶、出厂。而一般黄酒对澄清、过滤、调配等操作不大重视。,C.日本清酒,分白药和黑药。白药为早籼稻加辣蓼杀菌，抑制细菌生长。黑药则是加入桂皮，杜仲等20味中药，制保健酒。,2、葡萄酒,我国汉代（公元前138年），张骞出使西域带回
4、葡萄，并引进酿酒艺人，开始有了葡萄酒,经东汉，至唐朝时有了较大发展，葡萄酒的饮用也日趋广泛；13世纪，元朝期间，葡萄酒已是一个重要商品；1892年，华侨实业家张弼士在山东烟台开办张裕酿酒公司，并从国外引进葡萄品种，这是我国第一个近代的新型葡萄酒厂；葡萄酒是由葡萄发酵而成的一种饮料酒，是一种国际性饮料，是世界产量第二的饮料酒，因其酒精含量低，营养价值高，所以是饮料酒中主要的发展品种。,葡萄酒分类,按酒的颜色按含糖量按酿造方法按是否含有CO2,红葡萄酒白葡萄酒桃红葡萄酒,干葡萄酒半干葡萄酒半甜葡萄酒甜葡萄酒,天然葡萄酒加强葡萄酒加香葡萄酒,平静葡萄酒起泡葡萄酒葡萄汽酒,用果皮带色的葡萄制成，酒色呈
5、深红、鲜红、紫红或宝石红。,用白葡萄或红皮白肉葡萄的果汁制成，酒色呈浅黄、禾秆黄、金黄色或近似无色。,用带色红葡萄短时间浸提或分离发酵制成的，酒色呈桃红或浅玫瑰色。,含糖量50.1g/L,葡萄原料在发酵过程中不添加糖或酒精，即完全用葡萄汁发酵酿成的葡萄酒。,人工添加白兰地或脱臭酒精，以提高酒精含量；或添加糖份提高含糖量。,葡萄原酒浸泡芳香植物或药材制成的。,不含CO2的葡萄酒,CO2由葡萄酒加糖发酵产生或人工压入，酒中CO2含量在20 时保持压力0.35MPa。,CO2由葡萄酒加糖发酵产生或人工压入，酒中CO2在20 时在0.051-0.25MPa。,葡萄采下分选，厚皮的较好；去梗；表面消毒（
6、KMnO4浸，无菌水淋洗，灭表面病原菌）；发酵（温度20，2-3周，密闭或半密闭，皮厚的时间长些，皮薄的时间短些）；压榨：液体进行后发酵（20-25，一周），澄清，取上部液体，其中低挡的装瓶，较高档次的换桶（最好是橡木桶，橡木能产生抑菌物质，同时具有一种天然植物香）陈化三年（5）；渣进行蒸馏，调香，制成白兰地（酒精多）。,主要工艺,葡萄酒的再加工,起泡葡萄酒：是一种含CO2的葡萄酒，以葡萄酒为基础，通过加糖发酵产生或人工压入CO2。,香槟酒是起泡酒的一种,起源于法国，因产于法国香槟地区而得名。目前世界各国都产起泡酒，并都将含一定CO2的优质白葡萄酒称为香槟酒。,葡萄酒的再加工,白兰地：是一种以
7、水果为原料酿制而成的蒸馏酒，通常所说的白兰地是指以葡萄为原料生产的白兰地。原白兰地经橡木桶长期陈酿，调配匀兑，才能称为成品的白兰地。,白兰地商标上的英文缩写：V.O （Very Old） V.O.P （Very Old Pale） V.S.O.P （Very Superior Old Pale） X.O （Extra Old）,很老,极老,最老,超老,酒龄（即贮陈期）规定不低于5年,酒龄（即贮陈期）规定不低于10年,透明是为了更好地观察酒体的色泽；高脚可便于手控制酒体的温度；,盛装葡萄酒的杯子透明高脚杯,水：阔口短脚杯，可握杯脚以保留冷水温。白兰地：白兰地狭口大肚酒杯，置于两手间搓动，再手覆暖
8、杯以产生白兰地酒香。白葡萄酒：带阔口略微小的杯以截获酒香,握杯脚以保留其冷温。勃艮第红葡萄酒(Burgundy) ：用宽阔大酒杯以催生其复杂酒香。该杯略比白葡萄酒杯高些。香槟酒：狭窄有凹槽的杯，以减少酒的表面区域，防止气泡消散。红葡萄酒：酒杯中较大的那种，持握在杯体和杯脚相连之处。,3、啤酒,啤酒是用大麦酿制的饮料酒，是酒类中酒精含量最低的，而且营养丰富。,啤酒历史悠久，起源于大约9千年前的中东和古埃及地区，后跨越地中海，传入欧洲，19世纪末，随着欧洲强国向东方侵略，传入亚洲。,中国啤酒是从欧洲传入的，据考证，在1900年俄罗斯技师在哈尔滨建立了第一家啤酒作坊（乌卢布列夫斯基啤酒厂），此后五年
9、时间里，俄国、德国、捷克分别在哈尔滨建立另外三家啤酒厂。第一家现代化啤酒厂是1903年在青岛由德国酿造师建立的英德啤酒厂（青岛啤酒厂前身）。,大麦浸泡、发芽，烘干，去根，粉碎加入粉碎的米中糖化作用加蛇麻（酒花，忽布花的雌花）加酵母低温发酵（12-15，3-5天；20-28，30-48h）过滤其中装瓶灭菌的为熟啤，不灭菌的为生啤,按颜色分为黄啤和黑啤，黄啤为淡啤，黑啤为浓啤。原料是大麦。,按性质分为两类：生啤（散装）、扎啤、鲜啤、熟啤（瓶装）,干啤 糖含量4%,大麦主要原料，需制成麦芽后发酵。二棱大麦籽粒大而整齐，发芽均一，淀粉含量高，蛋白质含量较少，啤酒不易浑浊，过滤容易，为弥补淀粉不足，常用
10、大米补充。蛇麻花桑科葎草属，多年生缠绕茎植物。采用的是未受精的成熟雌花。是啤酒香味、苦味的来源；加速麦汁中高分子蛋白质的絮凝；提高啤酒起泡性和持泡性；可抑菌，增加麦汁和啤酒的生物稳定性。也可治牙疼，产于中国新疆、欧洲捷克。也称酒花、忽布花等。酶-淀粉酶，-葡聚糖酶，-淀粉酶，蛋白分解酶、半纤维素酶、支链淀粉酶。麦芽水浸泡高于大麦10cm，10，63h；15，40h；30，38h。发芽，50烘12h，80烘3-5h，水分控制在23%。胚根长度不超过麦粒的二分之一，有57%-70%麦子出芽，即停止。（黑啤：100烘，连麦芽表面焦化，外黑内白，麦芽要除根。）,原料,大麦适于酿造啤酒的原因：大麦便于发
11、芽，并产生大量的水解酶类；大麦种植遍及全球；大麦的化学成分适合酿造啤酒；大麦非人类食用主粮。,麦芽汁的制备麦芽粉碎，煮熟，糊化，保温30min，维持在50，取其二分之一再煮10min，加米粉，带送回糖化（65，30min），再取三分之一再煮10min，再送回糖化锅65，30min，过滤得麦芽汁，渣子可喂奶牛。加蛇麻花：100kg麦芽汁与1kg蛇麻混合煮沸，冷却 。发酵,前发酵：12-24h达高峰，T升到10，保持10-12天，过滤。后发酵：6-8周，T为0-2 ，密闭形成一定压力含CO2（0.45-0.5%），加木瓜蛋白酶，再过滤，过滤时加硅藻土（助滤剂）助滤，得生啤。灭菌30min，60-6
12、3，无沉淀，质量好，得熟啤。,过程,煮沸的目的：蒸发水分，浓缩麦汁；钝化全部酶和麦汁杀菌；蛋白质变性和絮凝；酒花有效组分的浸出；排除麦汁中特异的异杂臭气。,使啤酒清凉爽口、散热解暑。因为泡沫是由于啤酒中充满二氧化碳而促发起来的。这些二氧化碳进入胃中后，遇热而膨胀又通过打嗝排出体外，从而带走体内部分热量，达到散热解暑的功效。 软化啤酒花的苦味和酒精的刺激性。泡沫还可以隔绝空气与酒液直接接触，从而减少了啤酒的氧化，有利于防止不良气味的产生。 泡沫可以保持啤酒的杀口力即二氧化碳与口腔粘膜和舌面接触后的麻辣感。这种口感是评定啤酒质量的重要指标之一。 将优质啤酒倒入杯中时，泡沫能从杯中升起，可持续五分钟
13、以上，且细腻、洁白、挂壁、泡沫的持久性与细腻，持久，口味醇厚。啤酒的质量也就好。 气泡的稳定程度与液体的表面张力有关，而张力又与温度有关。据实验，啤酒的泡沫以10C-12C时最多，且持久，口感也最佳。,啤酒中泡沫的作用,最好用透明的洁净玻璃杯。透明杯子可以观察到泡沫升起的情况，欣赏到啤酒金黄有光泽的颜色。杯子要洁净无油渍，否则啤酒中的二氧化 碳气体会因接触油腻失去表面张力而使啤酒的泡沫很快消失。 杯子要大。在10 -12 啤酒中的泡沫最稳定，使用大杯子可以避免其中的啤酒温度过快升高而减少泡沫降低啤酒口味。,盛装啤酒的杯子,降低成本，加30%大米，提高淀粉含量。大麦发酵在红搅拌通气，缩短发芽时间
14、，提高发芽率。添加赤霉素，促进发芽。发酵时密封，提高温度，缩短发酵时间。采用固定化技术，用海藻酸钠，把酵母菌固定到海藻酸钠上，反复利用，省去过滤，发酵周期12-14天。,青岛啤酒,透明，麦芽香，CO2丰富，浓郁，3.5%酒精含量，泡沫细白、挂杯持久。,风味啤酒,加中药（生姜、香草、桂皮、杜仲）,新工艺,根据菌种制剂分大曲酒、小曲酒。大曲：砖形、大，主要用小麦、豌豆作培养基，菌种为曲霉。大曲用料多，需粉碎。优点是便于存放。大曲酒发酵时间长，产品质量好，但成本较高，出酒率偏低，全国名白酒、优质白酒和地方名酒的生产，绝大多数用大曲作糖化发酵剂。小曲：不定形、小，主要用大米、米、糠、中草药作培养基，菌
15、种为根霉，毛霉，可以是固体也可是液体，接种时用量少。,4、白酒,饮料酒生产如啤酒和葡萄酒等酿造酒，一般都是采用液态发酵，而我国白酒采用固态酒醅发酵和固态蒸馏传统操作，是世界上独特的酿酒工艺。,白酒发酵的原理糖质原料：甘蔗、废糖蜜等淀粉原料：高粱、玉米、马铃薯等纤维素原料：木屑、作物秸秆、甘蔗渣等 霉菌、细菌：将淀粉、纤维素转化为单糖 酵母菌：将单糖转化为乙醇,接种发酵,篜酒,发酵过程,浸米碾碎拌料加曲母（菌种）、草药（柴胡，茯苓）、陈皮、甘草，香附子制坯进箱保湿繁殖出箱烘干白曲：厦门一带使用，用米粉、米糠为原料，把人工培养好的根霉接入待培养。散曲：贵州一带使用，用麸皮（维生素含量多）为原料。,
16、A.制曲,（1）小曲（2）大曲（3）红曲,原料粉碎接菌加水调和踏曲成形入曲房（恒温，即进箱）培养出曲房干燥,洗米、浸泡、淋干蒸饭（七成熟）摊凉二次蒸饭摊冷接菌（菌种配成溶液喷上去）35保温培养三天后翻堆三天后浸水10-15min回曲房6天后出曲喷上水再回曲房6天后拿出晒干曲公：纯的红曲霉曲母：红曲霉加麸皮用来制红方腐乳，红醋，缺点是容易褪色。,B.小曲酒,米香型：桂林三花酒 曲中加了中药，酿酒用水为漓江水（源自猫儿山原始林区，水质晶莹、纯洁，最宜酿酒） 。酿造完成后放在天然溶洞中陈化。,发酵完成后经过反复二至三次蒸馏，酒精度数较高， 民间过去叫“三蒸酒”、“三熬酒”。古代没有酒度计，酿酒师们便
17、总结出了“观花论酒”的经验。当酒度在 55 至 60 时，由于液体表面张力，酒面晃动便泛起数层酒花，经久不散。酿酒师们说“起花了，三花！”就接酒。三花酒便由此而来。,董酒（贵州遵义）：含酒精58-60度。酒中加入米蒸馏的酒糟，加大曲发酵半年，再加小曲发酵蒸馏，既有大曲的浓香，又有小曲的清香。工艺：大米或高粱浸泡、蒸熟摊冷接种箱培，初期25-28，后期30-35培养菌种出箱换箱再加一次培养基装入木桶发酵出桶蒸馏（55，60，65，85）,C.大曲酒,酱香型 （茅型酒）,茅台产于贵州仁怀县茅台镇，原料为高粱，曲为纯小麦制高温曲，八次蒸软，八次下曲，八次发酵，八次蒸馏（但仅取酒7次，因为第一次蒸馏出
18、的不作正品，泼回酒窖重新发酵）。,庐州老窖产于四川泸州市，庐江、长江、沱江汇合处。千年窖，万年糟。纯小麦制大曲，以糯玉米为原料。根据酒的质量可分特曲、头曲、二曲和三曲。五粮液产于四川宜宾。采用五种粮食（高梁、大米、糯米、小麦、玉米）为原料。古井贡酒产于安徽亳州。历史悠久，明、清二代作为贡品。,浓香型 （庐型酒）,清香型 （汾型酒）,汾酒产于山西汾阳县杏花村，二次发酵二次勾兑。前次发酵21天，蒸馏，加酒糟，再发酵21天，再蒸馏。竹叶青（药酒）以汾酒为基础，加入竹叶、当归、砂仁、檀香等十二味中药 材作香料，加冰糖浸泡调配而成。酒液金黄微绿、透明。,（复）混香型,西凤酒产于陕西凤翔县柳林镇。采用60
19、大麦和40豌豆制大曲，以高梁为原料，清蒸高梁壳为辅料，发酵周期14天，陈化3天。,蒸大豆熟后与面粉相拌摊凉搬到曲房发黄（黄曲霉，米曲霉）黄子（1个星期）加盐水至半固体状态入缸用竹帘盖上晒压榨得汁再压榨增浓,二、酱油,传统：,（1）人工制米曲霉，接种，缩短发酵周期。（2）豆饼粉碎，蒸煮，冷却到55左右，加米曲霉孢子，30，一个月，加盐水（防止杂菌污染）（3）以小麦，麸皮为原料（米曲霉在麸皮上长的特别快）（4）无盐发酵：时间大大缩短，只要1-2天，但易染菌。（5）低盐保温发酵：盐浓度13%，用波美浮力比重计测。温度44-46 ，发酵7天后升高到48-50。再发酵三天，过滤。（6）酶法发酵：71%豆
20、饼+29%麸皮，磨碎，加水，水含量55%，加2-5%菌种，加6%NaCl，发酵35-40，时间5-9天，浸泡，过滤。（制风味酱油，加肌苷酸、鸟苷酸，非常鲜）,现在：,大豆酱最好，蛋白含量高100kg大豆，浸泡，蒸熟加40-60kg面粉混合加曲种0.15-0.3%豆曲入缸压实让其自然升温到40加14o盐水，淹没表面，再洒上细盐45下加盖，发酵10天补加20o盐水室温发酵4-5天。,三、酱,固态发酵：分大曲醋和小曲醋。大曲醋的代表是山西陈醋，以大麦、小麦、豌豆作原料；小曲醋的代表是镇江香醋，以米、小麦作原料。液态发酵：酒精醋山西陈醋：大麦、小麦、豌豆，50kg高粱+大曲31.3kg发酵8天室外夏天
21、晒冬天冻，要经过三个伏天，一个冬天。色黑紫，质浓厚，味清香，耐储存。镇江香醋：大米制成酒酿+粗糠发酵固定化法：将醋酸杆菌固定在玉米芯或陶瓷上，通乙醇。深层发酵：发酵后加鲜味剂，加色素。,四、醋,根毛菌孢子悬液接种豆腐，发酵7天27-28，豆腐上喷一层盐水。,五、豆腐乳,现代发酵产品,第一节 抗生素,抗生素是青霉素、链霉素、红霉素等一类化学物质的总称。它是生物，包括微生物、植物和动物在其生命活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性的抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞的有机物质。抗生素的生产目前主要用微生物发酵法进行生物合成。很少数抗生素如氯霉素、磷霉素等亦可用化学合成法生产。还可将生物合成法制得的
22、抗生素用化学或生化方法进行分子结构改造而制成各种衍生物，称半合成抗生素。,一、抗生素的分类,1. 根据抗生素的生物来源分类,放线菌产生的抗生素真菌产生的抗生素细菌产生的抗生素植物或动物的抗生素,链霉素；四环素；红霉素等,青霉素、头孢霉素等,多粘菌素等,被子植物蒜中制得的蒜素；从动物脏器中制得的鱼素等。,2. 根据抗生素的作用分类,广谱抗生素抗革兰氏阳性菌的抗生素抗革兰氏阴性菌的抗生素抗真菌抗生素抗病毒抗生素抗癌抗生素,氨苄青霉素,链霉素,制霉菌素,四环类抗生素对立克次体及较大病毒有一定作用,阿霉素,青霉素,3. 根据抗生素的化学结构分类,3. 根据抗生素的作用机制分类,抑制细胞壁合成的抗生素影
23、响细胞膜功能的抗生素抑制病原菌蛋白质合成的抗生素抑制核酸合成的抗生素抑制生物能作用的抗生素,头孢霉素、青霉素,多烯类抗生素,四环素,丝裂霉素C,抗霉素,3. 根据抗生素的生物合成途径分类,氨基酸、肽类衍生物糖类衍生物以乙酸、丙酸为单位的衍生物,头孢霉素、青霉素,链霉素,红霉素,二、 抗生素的应用,抗生素在医疗上的应用抗生素在农牧业中的应用,三、 抗生素生产的工艺过程,菌种孢子制备种子制备发酵 发酵液预处理提取及精制成品包装,以青霉素生产工艺为例,1. 菌种,常用菌种为产黄青霉。当前生产能力可达4000080000 u/ml。按其在深层培养中菌丝的形态，可分为球状菌和丝状菌。,2. 发酵工艺,3
24、. 培养基,碳源氮源前体无机盐,目前普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液进行流加。,可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸子粉，并补加无机氮源。,为生物合成含有苄基的青霉素G，需在发酵中加入前体苯乙酸或苯乙酰胺。采用多次加入方式。,硫、磷、钙、镁、钾等盐类。,青霉素产生菌生长发育可分为六个阶段：期、期、期、期、期、期,4. 发酵培养控制,期初称菌丝生长期，产生青霉素较少，而菌丝浓度增加很多；期适于作发酵用种子； 期称青霉素分泌期，此时菌丝生长趋势逐渐减弱，大量产生青霉素；在期末、期初即应放罐；期即菌丝自溶期，菌体开始自溶。,加糖控制补氮及加前体pH控制温度控制通气和搅拌泡沫和消泡,4. 发酵培
25、养控制,一般在残糖将至0.6左右，pH上升时开始加糖。,加硫酸铵、氨水或尿素，使发酵液氮源控制在0.010.05。补前体以使发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0.050.08。,加酸或碱自动控制pH，一般为6.46.6。,一般前期2526，后期23，以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。,抗生素深层培养需要通气与搅拌。,可用天然油脂如豆油、玉米油或用化学合成消泡剂“泡敌”（环氧丙稀环氧乙烯聚醚类）来消泡。应当控制其用量并少量多次加入。,5. 过滤6. 提炼7. 脱色8. 共沸蒸馏或直接结晶,宜采用鼓式真空过滤器。过滤前加去乳化剂降温。,采用溶媒萃取法，醋酸丁酯（BA）作溶媒。,采用活性炭进行脱色。过滤。
26、,第二节 微生物酶制剂生产工业,一、微生物酶工业的发展概况,人类利用微生物生产酶具有悠久的历史，最有代表性的就是制曲酿酒。19世纪末酶蛋白学术的建立，开创了酶工业生产的历史。1949年日本开始用深层培养法生产细菌淀粉酶。随着酶工业提纯技术的进步和应用领域的开发，果胶酶、葡萄糖氧化酶等也相继进入了工业化生产阶段。70年代后固定酶技术的发展，加速了酶制剂工业的发展。相继开发了脂肪酶、微生物凝乳酶、柚苷酶、磷酸二酯酶等。近年来又开发了青霉素酰化酶、异淀粉酶等等。,二、酶制剂的应用,食品工业洗涤剂纤维工业有机合成和制药工业医学上的应用用于分析化学和临床检验生物工程,三、酶制剂的生产,1. 固态发酵法,
27、微生物的培养物是固态，一般使用麸皮作为培养基。在曲房内将培养基拌入种曲后（固态，含水量60左右）铺成薄层（1cm左右）在曲盘或帘子上，然后置于多层架子上进行微生物的培养。培养过程中控制曲房的温度和湿度（90100），逐日测定酶活力的消长，待菌丝布满基质、酶活力达到最大值不再增加时，即可终止培养，进行酶的提取。固态培养法一般适用于霉菌的生产。起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术，生产简单易行，但劳动强度高。近年新发展了通风制曲工艺，在酶制剂的生产中仍占有重要作用。,三、酶制剂的生产,2. 深层液体培养法,采用在通风搅拌的发酵罐中进行微生物深层液体培养，是目前酶制剂发酵生产中最广泛应用的方法。,液
28、体深层发酵法的优点,机械化程度高，发酵条件易控制。酶的产率高、质量好。培养的无菌要求高，在生产上要特别注意防止染菌。,四、微生物酶制剂生产工艺举例淀粉酶生产工艺,一般在酶活达到最高峰时结束发酵，离心以硅藻土作为助滤剂去除菌体及不溶物。在钙离子存在下低温真空浓缩后，加入防腐剂、稳定剂以及缓冲剂后就成为成品。,为制造高活性的淀粉酶并便于贮运，可把发酵液用硫酸铵或有机沉淀剂沉淀制成粉状酶制剂，最好贮藏在25以下、较干燥避光的地方。利用蛋白酶比淀粉酶的耐热性差的特点，将淀粉酶的发酵液加热处理可以使淀粉酶的储藏稳定性大为提高。在培养基中添加柠檬酸盐可抑制某些菌株产生的蛋白酶，用底物淀粉进行吸附也可将淀粉
29、酶和蛋白酶进行分离。,（一）米曲霉固态法-淀粉酶生产工艺,1. 生产工艺流程,2. 发酵,将试管斜面（于3234培养7072h），接种到500mL三角瓶（每瓶一菌耳种菌），摇匀于3234下培养3d，每24h扣瓶一次以防结块，待菌体大量生长孢子转出黄绿色时，即可作为种子用于制备种曲。种曲房要保持清洁，并定期用硫磺和甲醛熏蒸灭菌。种曲培养一般采用木制或铝制曲盒，培养基经高温灭菌后放入种曲箱房，打碎团块冷却到30左右接入0.51的三角瓶种子，拌匀后放入曲盒，料层厚度1cm左右为宜。盒上盖一层布后放入专用的木架上，曲房内保持30左右进行培养。盖布应每隔812h用水浸湿，以保持一定湿度，每24h扣盘一次
30、，经3d后，种曲成熟，麦麸上布满黄绿色孢子。厚层通风固体发酵，蒸煮1h后培养基冷却到30接入0.5的种曲，拌匀后入池发酵。前期品温控制在30左右，每隔2h通风20min，当池内品温上升至36以上时则需要连续通风，使温度控制在3436。当池内温度开始下降后23h则通冷风使品温下降到20左右出池，整个发酵过程约需要28h。,2. 提取,直接把麸曲在低温下烘干，作为酿造工业上使用的粗酶制剂，特点是得率高、制造工艺简单，但酶活性单位低，含杂质较多。把麸曲用水或稀释盐水浸出酶后，经过滤和离心除去不溶物后用酒精沉淀或硫酸铵盐析，酶泥滤出烘干，粉碎后加乳糖作为填充剂最后制成供作助消化药、酿造等用的酶制剂。特
31、点是酶活性单位高，含杂质较少，但得率低、成本高。,（二）枯草杆菌BF-7658深层液体发酵-淀粉酶生产工艺,枯草杆菌BF-7658淀粉酶是我国产量最大、用途最广的一种液化型-淀粉酶，其最适温度65左右，最适pH6.5左右，pH低于6或高于10时，酶活显著下降。其在淀粉浆中的最适温度为8085，90保温10min，酶活保留87。,1. 生产工艺,2. 发酵,孢子培养一般采用马铃薯培养基，于37下培养72 h，使菌体全部形成孢子即为成熟。种子培养维持罐温37，罐压0.50.8 atm，10h后加大通风，当菌体处于对数生长期后期，立刻接种至大罐，种子培养一般14h左右。发酵控制温度37，罐压0.5
32、atm，通气量012 h控制0.50.6 VVM，12 h后控制在0.81.0 VVM，发酵后期控制在0.9 VVM。发酵培养一般采用补料工艺，一方面可解除分解代谢阻遏效应，另一方面也有利于pH的调节，最终达到提高产量的作用。补料体积和基础培养基体积一般为1:3左右。从10 h左右开始补加，一般前期、后期少，中期大，根据菌体的生长情况来调整。当pH低于6.5，细胞生长粗壮时可酌减；当pH高于6.5，细胞出现衰老并有空胞时可酌增，发酵周期一般为40 h。,3. 提取,工业上回收-淀粉酶一般采用硫酸铵盐析法。硫酸铵浓度、酶液的浓度和pH对盐析效果都有影响，甚至-淀粉酶来源或菌种不同对硫酸铵浓度的要
33、求也不同，如枯草杆菌-淀粉酶的硫酸铵浓度一般为3750不等。,第三节 氨基酸生产工艺,目前世界上可用发酵法生产的氨基酸已有20多种（包括酶法生产的氨基酸），发酵法已成为氨基酸生产的主要方法。,一、氨基酸的用途,食品工业饲料工业医药工业化学工业农业,目前生产的20多种氨基酸中，产量最大的是谷氨酸，约占总产量的75，其次为赖氨酸（约为总产量10），其他约占15左右。从消费构成来看，食品行业的用量约占66，饲料占30，其他4。,二、氨基酸的生产方法,抽提法发酵法合成法酶法,生产氨基酸最早采用的生产方法。将蛋白质原料酸水解，然后从水解液中抽提出氨基酸。,目前最常用的生产方法。直接发酵：利用微生物的作用
34、直接将粮食原料经过发酵生产氨基酸；添加前体发酵：在发酵中添加氨基酸代谢途径上的中间产物，利用微生物的作用转化为相应的氨基酸。,用化学合成的方法制造氨基酸。,利用微生物产生的酶来制造氨基酸。,三、谷氨酸发酵,利用淀粉水解糖为原料通过微生物发酵生产谷氨酸的工艺，是最成熟、最典型的一种氨基酸生产工艺。,1. 淀粉水解糖的制备,国内味精厂多数采用淀粉酸水解工艺国外味精厂淀粉水解糖的制备方法一般采用酶水解法，则在水解液中的色素等杂质明显减少，并简化了脱色工艺。,原料（淀粉、水、盐酸）调浆（液化）糖化冷却中和、脱色过滤糖液,2. 菌种扩大培养,斜面培养一级种子培养二级种子培养发酵,（1）斜面培养,谷氨酸产
35、生菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属的细菌。这些菌都是需氧微生物，都需要以生物素为生长因子。,（2）一级种子培养,培养基,葡萄糖玉米浆尿素磷酸氢二钾硫酸镁硫酸铁硫酸锰pH6.56.8,在32培养12 h，如无杂菌与噬菌体感染，质量达到要求，即可贮于4冰箱备用。,以1000mL三角瓶装液体培养基200250mL进行振荡培养。,（3）二级种子培养,二级种子用种子罐培养，料液量为发酵液投料体积的1，培养基组成和一级种子相仿，主要区别是用水解糖代替葡萄糖，一般于32下进行通气培养710h经质量检查合格即可移种（或冷却至10备用）。种子质量要求，首先是无杂菌及噬菌体感染，在这个基础上进一步
36、要求菌体大小均匀，呈单个或八字形排列。二级种子培养结束时还要求活菌数为108109个细胞/mL。,3. 谷氨酸发酵,发酵初期，即菌体生长的迟滞期，糖基本没有利用，尿素分解放出氨使pH值略有上升。这个时期的长短决定于接种量、发酵操作方法（分批或分批流加）和发酵条件，一般为24h。接着进入对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，尿素大量分解，pH值很快上升，但随着氨被利用pH值又下降；溶氧浓度急剧下降，然后又维持在一定水平上；菌体浓度（OD值）迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。这个时期，为了及时供给菌体生长必需的氮源及调节培养液的pH值至7.58.0，必须流加尿素；又由于代谢旺盛，泡沫增加并放出大量发酵
37、热，故必须进行冷却，使温度维持3032。菌体繁殖的结果，菌体内的生物素含量由丰富转为贫乏。这个阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，一般为12h左右。,3. 谷氨酸发酵,当菌体生长基本停滞就转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段，为了提供谷氨酸合成所必需的氨及维持谷氨酸合成最适的pH7.27.4，必须及时流加尿素，又为了促进谷氨酸的合成需加大通气量，并将发酵温度提高到谷氨酸合成最适的温度3437。发酵后期，菌体衰老、糖耗缓慢、残糖低，此时流加尿素必须相应减少。当营养物质耗尽酸浓度不再增加时，需及时放罐，发酵周期一般为30多小时。,为了实
38、现发酵工艺条件最佳化，国外利用电子计算机进行过程控制，目前国内也正在积极开发这方面的技术。,4. 谷氨酸提取,从谷氨酸发酵液中提取谷氨酸的方法，一般有等电点法、离子交换法、金属盐沉淀法、盐酸盐法和电渗析法，以及将上述某些方法结合使用的方法。,（1）等电点法,操作方便，设备简单，一次收率达60左右，但周期长，占地面积大。,（2）离子交换法,过程简单、周期短，设备省、占地少，提取总收率可达8090，但酸碱用量大、废液污染环境。,第四节 维生素生产工艺,维生素是一类性质各异的低分子有机化合物，是维持人体正常生理生化功能不可缺少的营养物质。,一、维生素的分类,维生素可分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大
39、类。,二、维生素的生产方法,生产维生素的方法有三种：提取法，化学合成法，生物合成法。,提取法是从富含维生素的天然食物或药用植物中浓缩、提取而得。目前只有极少数得维生素采用提取法。如维生素A原、维生素E等。化学合成法是目前生产维生素得主要方法。微生物发酵法和微藻类的生物转化法（统称生物合成法）发展非常快。,三、维生素C生产工艺,1. 维生素C的合成方法,维生素C的合成方法主要有莱氏化学合成法和微生物发酵合成法两种。,（1）莱氏化学合成法,1933年德国Reichstein等人首先用化学合成法制取维生素C获得成功。至今许多国家仍采用此方法或采用改进的莱氏法进行工业生产。该方法以D山梨醇作原料，需经
40、四大步反应，才能得到维生素C产品。,D-山梨醇经黑醋菌（Gluconobacter melagenus）发酵得L-山梨糖；L-山梨糖和丙酮反应制得二丙酮-L-山梨醇；二丙酮-L-山梨醇氧化得二丙酮-2-酮-L-古龙酸钠，再经酸化得二丙酮-2-酮-L-古龙酸；二丙酮-2-酮-L-古龙酸经转化得维生素C。,（1）莱氏化学合成法,D-山梨醇经黑醋菌（Gluconobacter melagenus）发酵得L-山梨糖；L-山梨糖和丙酮反应制得二丙酮-L-山梨醇；二丙酮-L-山梨醇氧化得二丙酮-2-酮-L-古龙酸钠，再经酸化得二丙酮-2-酮-L-古龙酸；二丙酮-2-酮-L-古龙酸经转化得维生素C。,（1）
41、莱氏化学合成法,D-山梨醇经黑醋菌（Gluconobacter melagenus）发酵得L-山梨糖；L-山梨糖和丙酮反应制得二丙酮-L-山梨醇；二丙酮-L-山梨醇氧化得二丙酮-2-酮-L-古龙酸钠，再经酸化得二丙酮-2-酮-L-古龙酸；二丙酮-2-酮-L-古龙酸经转化得维生素C。,（1）莱氏化学合成法,D-山梨醇经黑醋菌（Gluconobacter melagenus）发酵得L-山梨糖；L-山梨糖和丙酮反应制得二丙酮-L-山梨醇；二丙酮-L-山梨醇氧化得二丙酮-2-酮-L-古龙酸钠，再经酸化得二丙酮-2-酮-L-古龙酸；二丙酮-2-酮-L-古龙酸经转化得维生素C。,（1）莱氏化学合成法,改进
42、莱氏法（碱转化）,（2）微生物发酵合成法,D-山梨醇途径L-山梨糖途径L-艾杜糖酸途径2-酮-D-葡萄糖酸途径2,5-二酮-D-葡萄糖酸途径2-酮-L-古龙酸途径,从葡萄糖出发，采用微生物发酵合成维生素C，有以下六种合成途径：,六种合成途径之间既有联系又有区别。,六条不同的微生物发酵合成途径最终都是以2-酮基-L-古龙酸（简称2KGA）为最终产物，再经化学转化合成维生素C。在这六条合成途径中，只有第二条途径已实现了工业化生产。此即为我国自行开发的二步发酵法。,2. 二步发酵法生产工艺,优点：制备工艺简单，生产周期短和“三废”污染少等。1985年转让给世界上生产维生素最大企业瑞士霍夫曼罗氏制药公
43、司。我国医药工业史上首次出口技术。,二步发酵法生产工艺有酸转化工艺和碱转化工艺两种。酸转化设备简单、流程短，但制得的维生素C破坏严重、质量差，设备腐蚀严重，三废多，因此逐渐淘汰。碱转化虽然流程较长、投资大，但产品质量好，故目前绝大部分工厂均采用碱转化工艺。,（一）二步发酵法反应步骤,（二）二步发酵法生产维生素C的工艺流程,二步发酵法的整个工艺流程可分为发酵、提取、转化和精制四部分。,（1） 发酵,（2） 提取,（3） 转化,（4） 精制,（三）二步发酵菌种及发酵工艺,（1）第一步发酵A. 菌种,一步发酵中所用菌种为生黑葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter melagenus），简称黑醋菌。
44、最常用的生产菌株为R-30，其主要特征是：细胞椭圆至短杆状，G+，无芽孢，大小为（0.50.8）m（1.02.2）m。端生草根鞭毛运动，菌落边缘整齐，微显浅褐色。生长最适温度为34，氧化D-山梨醇的发酵收率可达98以上。,（1）第一步发酵B. 培养基,无机盐溶液的组成：MgSO47H2O 1.25 g/100mL，(NH4)H2PO4 7.5 g/100mL，KH2PO4 5 g/100mL，K2SO4 1.25 g/100mL。,（1）第一步发酵C. 发酵过程特征,在发酵过程中，控制发酵温度34，初始pH5.15.3。该氧化反应的耗氧量较大，所以通气比要求1:1 VVM以上。即使在通气量较大
45、，且搅拌转速较高的条件下，发酵至4h后溶解氧浓度急剧下降，甚至接近于零。直到10h左右才逐渐回升。当溶解氧浓度回复至最高点，呈水平直线时，表示该反应已达终点。该发酵过程受山梨醇底物浓度的影响，当其浓度超过250 g/L时，底物对产物形成有抑制作用。故要获得高浓度山梨糖时，必须采用流加发酵方式。为了配合第二步的高浓度山梨糖流加发酵工艺，尽可能提供一步发酵的最终山梨糖浓度是至关重要的。目前山梨糖浓度可达450 g/L。,（2）第二步发酵A. 菌种,小菌为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans），大菌可采用,巨大芽孢杆菌（Bacillus megateriam），称2980菌，
46、或蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），称152菌，或浸麻芽孢杆菌（Bacillus macerans），称169菌。,也可采用其他一些杆菌与小菌混合培养。,工业生产过程中使用最多的为2980及152混合菌。,第二步发酵采用的菌种为由大、小两株细菌组成的混合菌种。,氧化葡萄糖酸杆菌的主要特征为：细胞椭圆至短杆状，G-，无芽孢。30培养2d后大小为（0.50.7）m （0.61.2）m ，单个或成对排列。在葡萄糖培养基上生长极微弱，甘露醇培养基上生长良好。,（2） 第二步发酵B. 培养基,（3） 第二步发酵C. 发酵过程特征,第二步发酵为混合菌种发酵。由于大、小菌两者的最适培养条件是不
47、同的，所以其操作适宜条件是兼顾大、小菌两者的条件。通常操作温度为30；初始pH控制在6.8左右。该反应虽属氧化反应，但对氧的消耗并不很大。气升式发酵罐非常适合该发酵过程。溶氧浓度控制在20即可。山梨糖的初始浓度对产物的生成影响较大。间歇发酵时初始山梨糖浓度超过80 g/L，会对产物生成产生抑制。所以要取得高浓度2KGA，需采用高浓度山梨糖流加发酵方式。若采用建立在数学模型基础上的流加控制策略，可获得高浓度的2KGA，二步收率可达83。,四、 生物合成法生产维生素的前景,对自然界中微生物及藻类进行广泛和深入的筛选和分离，以获得优良的生产菌株。对现有生产菌株用突变等方法进行改造，以提高其生产能力。利用基因重组技术，获得高产基因工程菌株。,第五节 基因工程菌产品的生产与研究概况,干扰素源自克隆基因的蛋白外源蛋白酵母表达系统疟疾疫苗重组人血清蛋白人血清白蛋白基因的合成及其在酵母中的表达氨基酸肌苷酸和鸟苷酸微生物多糖,
