实验1特殊显微镜结构及操作技术.ppt

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资源描述

1、实验1 特殊显微镜结构及操作技术,【目的】 了解TE2000-U型倒置显微镜的基本组件、原理,掌握其基本操作。【材料】 1高等动、植物各类组织永久制片; 2培养皿(瓶)中的活细胞或微生物; 3口腔上皮细胞的临时装片。,【实验用品】,1试剂:10g/mL罗丹明123的磷酸缓冲液(PBS)荧光染料。2器材:倒置显微镜,相差显微镜附件(相差物镜、转盘聚光器、对中环形光阑和绿色滤色镜等),微分干涉显微镜附件(起偏镜、检偏镜和渥拉斯顿棱镜等),荧光显微镜附件(荧光发射器、激发滤片和阻断滤片等),载玻片,盖玻片,牙签,滤纸条,擦镜纸,镊子,滴管。,【实验原理和方法】,倒置显微镜是一种用于生物组织细胞离体培

2、养观察的光学显微装置,能直接对培养皿、培养瓶的标本进行显微观察。由于它的物镜、物体和光源位置刚好与立式显微镜颠倒,被称为倒置显微镜。倒置显微镜的物镜在下,聚光器在上,被观察样品置于位于上方的聚光器之下,聚光器具有远大于物镜的工作距离。因此,适应于培养皿或培养瓶中样品的观察。高档倒置显微镜可根据不同观察要求,增加相差、微分干涉反差物镜或荧光发射装置,构建成相差显微镜、微分干涉显微镜或荧光显微镜。,一、倒置显微镜的构造与使用,(一)倒置显微镜的构造倒置显微镜由目镜、透射照明器、聚光器、载物台、物镜和显微镜机体等部件构成,以TE2000-U显微镜为例介绍。TE2000-U 显微镜配有:T-DH 10

3、0W 透射照明器、LHS-H100P-1 12V100W 灯室、12V100W 卤素灯、TE2-PS100W 电源、T-SR 矩形载物台、T-TD 双目镜筒D、CFI 10X 目镜、T-N6 六孔物镜转换器,系统聚光器、物镜、电源线等。,1. 目镜筒及目镜 A:屈光度调节环 B:目镜 C:目镜筒转盘O:开 B:勃氏镜(带有聚焦螺钉) C:关(光闸) M:2.5 倍放大,2. 显微镜机体,3. 透射照明器: 透射照明器必须根据规定使用灯泡(12V100W 或6V30W)。T-DH 100W 透射照明器需灯室。,A: 视场光阑调节杆 B: 滤色片滑片C: 聚光器再聚焦制动器 D: 聚光器调焦旋钮E

4、: 聚光器固定螺钉 F: 聚光器安装定位孔G: 聚光器安装定位槽 H: 聚光器转动指紧螺钉I: 聚光器调中螺钉 J: 聚光器安装(可转动)支架K: LHS-H100P-1 12V100W 灯室 L: 灯室固定螺钉M: 灯室盖指紧螺钉 N: 聚光器支架(可移动)O: 聚光器支架指紧螺钉 P: 灯室线Q: 聚光器支架下降定位螺钉,T-DS 30W 透射照明器 A: 防尘滑片(可移动) B: F 堵口滑片(可移动) C: 聚光器安装支架 D: 6V30W 灯室 E: 滤色片滑片 F: 安装附加装置M4 螺纹孔,系统聚光器,T-DH 100W 透射照明器 A: 聚光器孔径光阑B: 聚光器模块C: 聚光

5、器模块固定螺钉D: 聚光镜(有三种可选:ELWD、LWD、HMC)E: 环形光阑调中螺钉(仅用于相差模块中),T-DS 30W透射照明器(霍夫曼观察),ELWD-S 聚光器,A:调中杆指紧螺钉B:调中杆 C:转盘,SLWD 聚光器,T-SR矩形载物台,A:载物环湾 B:载物台Y 轴方向移动控制旋钮 C:载物台X 轴方向移动控制旋钮,(二)由TE2000-U,100W 透射照明器,系统聚光器,以及T-TD 目镜筒D 组成的显微镜系统。,明视场(BF)镜检关键点: 从光路中卸下其它形式观察需要的所有光学组件,聚光器调节好(调节聚焦和对中),转动孔径光阑调节好像的清晰度。,1. 复位,1) 逆时针转

6、动,松开透射照明器中的“聚光器再聚焦指紧螺钉”。2) 把“目镜筒转盘”设置到O位。3) 把显微镜右侧的“中间放大倍数刻度盘”打到1X。4) 逆时针转动,松开显微镜右侧粗微调旋钮后面的“物镜再聚焦定位环”,2. 打开透射照明器,1) 把电源后部的“外部开关”打到开的位置;2) 把电源“电源开关”打开。(把开关拨至);3) 按下显微镜左侧的“照明器开关”接通灯泡。,3. 调节灯泡亮度保证色彩真实。,1) 把显微镜左侧的“亮度调节盘”设置成12V100W;2) 把透射照明器中的“NCB11 滤色片”插入光路中;3) 把透射照明器中的“ND4 滤色片”插入光路中。,4. 调节光路,1) 把10X 物镜

7、转到光路中。2) 把显微镜右侧的“光路转换盘”转到1的位置。(100%光到观察口)3) 向上推透射照明器上的“视场光阑杆”完全打开视场光阑。4) 将系统聚光器上的“孔径光阑杆”转至右侧极限处把“孔径光阑”完全打开。5) 转动聚光器调焦旋钮把聚光器调至最低位置。,5. 明视场观察时对显微镜的调整,把“聚光器转盘”转到A位置。,6调节视度及瞳距,1)将显微镜前部的“摄影取景框转盘”逆时针旋转,使摄影取景框进入光路。2)用左眼对着左侧目镜,转动目镜 “屈光度调节环”,使取景框中的双十字线清晰成像。3)用右眼对着右侧目镜,转动目镜 “屈光度调节环”,使取景框中的双十字线清晰成像。4)将显微镜前部的“摄

8、影取景框转盘”顺时针旋转,使其退出光路。5)调节目镜瞳距,将两目镜视场所见的影像重合在一起。,7. 调焦,1)将样品放置载物台中。2)转动同轴粗微调旋钮,将标本对好焦。,8. 聚光器中心调节,1)确信10X 物镜在光路中。2)将“视场光阑调节杆”降低直到能从目镜看到视场光阑像。3)转动“聚光器调焦钮”升降聚光器,使视场光阑像清晰地成象在标本面上。4)转动两个“聚光器中心调节螺钉”,使视场光阑像在视场中心。5)更换40X 物镜。6)调节“视场光阑调节杆”,使视场光阑的象与视场大致相同。7)转动两个“聚光器中心调节螺钉”,使视场光阑像在视场正中。,9. 进行观察,1)选择要使用的物镜2)移动系统聚

9、光器上的“孔径光阑调节杆”,使孔径为物镜数值孔径的7080%。(“把目镜筒转盘”设到B位置,转动勃氏镜调焦螺钉使其聚焦,当观察到物镜的出瞳和孔径光栏的象时,调节其大小。)3)调节“视场光阑调节杆”使视场光阑像与视场相大致相同。4)把透射照明器里的“ND 减光片”进入或退出光路以调节视场亮度。,10. 更换样品,利用显微镜主体上的“物镜再聚焦定位环”,照明器上的“倾斜装置”,“聚光器再聚焦指紧螺钉,可容易更换样品。,11. 显微镜操作结束后,1) 关闭电源开关(开关拨至O)2) 灯室冷却后,把显微镜上的聚乙烯防尘罩盖好。,相差(PH)显微术,观察透明细胞或其他透明样品,需配相衬聚光器、相衬物镜、

10、相衬环等附件。相衬板将衍射光推迟1/4波长,振幅相减,样品暗,背景亮,称正反差或暗反差,分正低(DL)、正低低(DLL)和中型暗相差(DM)。折光率较强的样品用后者。相衬板将直射光推迟1/4波长,振幅相加,样品亮,背景暗,称负反差或明反差,分负中(NM)和负高(NH)。折光率较小的样品用后者。,关键点:将有ph 标记的物镜与物镜相同ph 标记的聚光器模块一起送入光路,在进行显微术前,校正(对中)物镜里的相差板及聚光器模块里的环形光阑。,1. 用明视场(BF)显微术对样品聚焦。2. 相差观察时对显微镜的调整。,1) 将ph 物镜转入光路。2) 转动“聚光器转盘”,使其与在光路中的物镜(步骤1中所

11、安置的)具有相同的ph 标记。3) 向右转动聚光器上的“孔径光阑调节杆”,完全打开孔径光阑。,3. 对中环形光阑,1) 把“目镜筒转盘”设到位置,转动勃氏镜聚焦螺钉,使环形光阑像清晰。2) 用六角起子转动聚光器模块中的两个“环形光阑对中螺钉”,使环形光阑像与物镜中的相差板环形像同心。3) 把目镜筒转盘位置再转到上。调中心手轮,4. 进行观察,1) 把聚光器“孔径光阑”完全打开。2) 移动透射照明器上的“视场光阑调节杆”,使视场光阑像大小与视场大小接近。3) 把透射照明器上的“NCB11 滤色片”从光路中移开,把“GIF 滤色片”移进光路。(提高反差)4) 可通过把“ND 滤色片”移进或移出光路

12、来调节视场亮度。,5. 使用不同放大倍数的物镜进行观察,1) 把所需放大倍数的相差物镜移入光路。2) 转动“聚光器转盘”,使其与在光路上物镜(步骤1中所安置的)具有相同的ph 标记。3) 调节放入光路中的环形光阑中心。(见程序3),6. 更换样品利用使用显微镜主机上的“物镜再聚焦定位环”,透射照明器上的“倾斜”装置及“聚光器再聚焦指紧螺钉”,可容易更换样品。7. 显微镜操作结束后与明视场显微术步骤相同。,微分干涉(DIC)显微术,可观察到样品的立体感,适用于显微操纵等,彩色图像。因塑料培养皿的不均衡张力在DIC下呈现干涉条纹、DIC不宜用于普遍使用的塑料培养皿。DIC的光通亮大,可用到100倍

13、物镜。需配DIC聚光器等附件,使用明场物镜。1用明场找到视野2压入起偏器,选择相应模块3调节孔径光栅至最佳效果。,荧光(E)显微术,适用于本身属于或被染色后形成荧光体的样品。荧光体在一定波长光(紫外或可见)的激发下发光(即荧光,波长长于激发光)。需配荧光附件和滤光器等。前者主件为激发光源,一般分汞灯系统和卤灯系统,汞灯既适用于紫外光激发也适用于可见光激发,且能量较高;后者只适用于可见光激发。(此处插入拍摄图片),1. 操作之前要求:,(1)检查荧光装置的工作时间,如荧光灯的工作时间超过使用寿命,应予以更换。(2)使用物荧光载波片(3)每次使用之间必须间隔20分钟。,2. 用明场找到视野。3. 关闭明场光源,打开荧光电源预热5分钟。4. 开启荧光盘,并根据要求选择荧光通道。5. 激发荧光发生器,打开光闸,即可进行观察。,

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