1、 本科毕业论文 （ 20 届） 维生素 C 修饰的纳米硒抗菌性能研究 所在学院 专业班级 食品质量与安全 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 . I Abstract . II 引言 . 1 1 实验材料与设备 . 2 1.1 实验材料 . 2 1.2 主要仪器设备 . 2 2 实验方法 . 2 2.1 试剂的配置 . 2 2.2 实验仪器的准备 . 3 2.3 斜面活化和菌悬液的制备 . 3 2.4 VcSe 样品梯度浓度 . 3 2.5 菌种稀释度的选择 . 3 2.6 VcSe 抑菌作用的测定 . 3 2.7 半数抑菌浓度的测定 . 4 3 实验结果 .4 3.
2、1 菌种稀释度选择的结果 . 4 3.2 抑菌圈测定结果 . 4 3.3 半数抑菌浓度的测定结果 . 5 4 结论 . 6 参考文献 . 8 致谢 . 9 I 摘要 本文以维生素 C 修饰的纳米硒（ VcSe）为研究对象，采用滤纸片抑菌法、带毒平板法，测定其对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果。实验结果表明随着VcSe浓度的增加对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径也随之增加，且其半数抑菌浓度为 1.5 mg/L。然而， VcSe 对枯草芽孢杆菌没有抑菌作用。实验表明 VcSe 对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果。 关键词： VcSe；抑菌作用；滤纸片抑菌法；半数抑菌浓度。 II Abstract In
3、 this paper, we used vitamin C to modify nano-selenium (VcSe) which as the object of study, and using filter paper antibacterial method, drug plate method to determine its Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis antibacterial effect.The results showed that the diameter of Staphylococcus aureus b
4、acteriostatic was increased with the increasement of concentration of VcSe, and the half inhibitory concentration of it was 1.5 mg / L.However, VcSe has no bacteriostatic effect on Bacillus subtilis. Experiments showed that VcSe has a good bacteriostatic effect on Staphylococcus aureus. Key words: V
5、cSe; bacteriostasis; filter paper antibacterial method; half inhibitory concentration.1 引言 细菌抗药性已成全球日益突出的问题，过度使用抗菌药物、抗生素品 种及剂量选择错误、抗生素给药途径、给药次数的不规范增加了细菌的抗药性 1。我国作为抗生素的生产和消费大国，由于长期药物不合理使用及监管的缺乏，导致的抗生素耐药性问题十分严峻，耐药感染性疾病已成为当前临床感染性疾病死亡的主要原因 2。因而，对新型的非抗生素类抗菌物质的需求日益迫切。 维生素 C（ 又名抗坏血酸）与人体健康关系密切，是一种重要而特殊的水溶性维
6、生素，具有分子结构最为简单，理化性质不稳定的特征，但维生素 C 可促进人体抗体的形成，提高白细胞的吞噬能力，提高人体对疾病的抵抗力和对寒冷的耐受力，从而增强人体的免疫功能 3。硒作为人体所必需的微量元素， 是谷胱甘肽过氧化物酶的重要成分， 具有广泛的生理功能和药理功能，微量元素硒的生物功能主要通过含硒酶来实现，如调节免疫、抑制病毒的突变、减弱一些致病菌的致病力、预防癌症等 4。研究表明， 亚硒酸钠对金黄葡萄球菌有抑菌作用，且随浓度的增大抑菌能力增强 5。然而， 硒的生物效应和毒性浓度范围相当的狭窄稍微超过了营养水平便会表现出毒性 6。纳米硒的诞生，解决了硒的应用难题。纳 米硒属于硒的一种，具备
7、了无机硒的生物活性，并且纳米硒具有较其更高的活性和安全性，对于人体来说具有更快的吸收效率和更低的毒性，这可避免了传统硒的副作用，是目前最安全的硒制品 7。 Vc 修饰的纳米硒可以克服 Vc 易被氧化、亚硒酸钠不稳定及毒性较大等缺点，因此， 本实验利用VcSe 溶胶作为研究对象，选用滤纸片法和它对金黄色葡萄球菌及枯草杆菌的半数浓度这个指标的抑菌效果来研究其抑菌效果，探究 VcSe 其抗菌功能，为 VcSe 作为纳米材 料类抑菌剂的应用提供理论依据。 2 1 实验材料与设备 1.1 实验材料 试剂名称 规格 产地 氯化钠 盐酸 分析纯 分析纯 天津市永大化学试剂开发中心 西陇化工股份有限公司 氢氧
8、化钠（粒） 分析纯 天津市欧博化工有限公司 琼脂粉 250g 北京奥博星生物技术有限责任公司 蛋白胨 250g 北京奥博星生物技术有限责任公司 牛肉膏 500g 北京奥博星生物技术有限责任公司 1.2 主要仪器设备 仪器名称 产地 BS224S 电子天平 北京赛多利斯仪器有限公司 GPX-9248A 干燥箱 上海跃进医疗器械有限公司 SB3200DTDN 超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司 D-1 型自动蒸汽灭菌锅 北京发恩科技有限公司 SPX-250- 生化培养箱 上海跃进医疗器械有限公司 电子万用炉 SHA-C 水浴恒温振荡器 北京市永光明医疗仪器厂 金坛市天竟公司 2 实验方法
9、2.1 试剂的配置 NaOH 试剂的配置：准确称取粒状 NaOH 4.0 g 置于 250 mL 的干净烧杯中，用量筒量取蒸馏水 98 mL 左右后再用滴管滴定至 100 mL，倒入烧杯中用玻璃棒摇匀，待完全溶解后用保鲜膜封口。 牛肉膏蛋白胨固体培养基的配置：蛋白胨 2.0 g，牛肉膏 0.6 g， NaCl 1.0 g，琼脂3.0 g，水 200 mL：将除琼脂外的其他成分溶解在水中，用 1.0 mol/L 的 NaOH 溶液将pH滴定到 7.4 左右；加入琼脂后用电子炉加热溶解，放入自动蒸汽灭菌锅中灭菌 20 min。 牛肉膏蛋白胨液体培养基的配置：蛋白胨 2.0 g，牛肉膏 0.6 g，
10、 NaCl 1.0 g，水 200 mL：将全部成分溶解在水中，用 1.0 mol/L 的 NaOH 溶液将 pH 滴定到 7.4 左右；放3 入自动蒸汽灭菌锅中灭菌 20 min。 2.2 实验仪器的准备 将实验需要 的试管、培养皿洗干净烘干，镊子、滤纸片、涂布器和装盒好的移液枪头用报纸包好于灭菌锅中灭菌 20 min，待气压为零时取出，放入干燥箱中烘干备用。 2.3 斜面活化和菌悬液的制备 金黄色葡萄球菌、枯草杆菌菌种活化：在无菌室中用配好的固体培养基倒入 2 只试管中，倒入的量为试管容量的 1/4，将试管倾斜冷却凝固。 用过酒精灯火焰后的接种环从已经长好的菌种中挑取少许菌种用斜面画线法进
11、行接种。培养 2 天之后，取已经活化的的菌种用接种环挑取两环于液体培养基中摇匀，放入摇床培养 12 h 后放入 4 冰箱备用。 2.4 VcSe 样品梯度浓度 表 1 VcSe 样品浓度梯度 3.0mg/L 2.5mg/L 2.0mg/L 1.5mg/L 1.0mg/L 0.5mg/L VcSe 100.0 L 83.0 L 67.0 L 50.0 L 33.0 L 17.0 L 蒸馏水 0.0 L 17.0 L 33.0 L 50.0 L 67.0 L 83.0L 2.5 菌种稀释度的选择 将两种菌悬液分别用移液枪取 100 L 菌悬液于 900 L 水的试管中摇匀，再取100 L 加入 9
12、00 L 水中，如此重复，分别将稀释度定为 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、10-6，用移液枪取 200 L 的稀释后的菌液加到准备好的培养基上，用涂布器将其涂匀，用相同的方法将另一种菌液重复操作后，把完成的培养基放入 37 培养箱中 24 h，观察生长情况。 2.6 VcSe 抑菌作用的测定 实验采用滤纸片法 8对 VcSe 的抗菌能力的测定，首先准备 7 mm 的圆形滤纸片若干灭菌，烘干；用移液枪将配制好的 VcSe 样品按不同浓度取出 100 L 分别置于 9 个灭菌完的试管中，这里选择 3.0 mg/L、 2.0 mg/L、 1.0 mg/L 的样品进行实验，
13、用镊子夹取滤纸片放入 9 个试管中浸泡 2 h 后无菌风干。将灭完菌的培养基冷却至 60 倒入培养皿中，每个培养皿为 20 mL 左右，倒完后水平放置培养皿，待培养基凝固。用移液枪取 100 L 菌悬液于 900 L 水的试管中摇匀，再取 100 L 摇匀后的菌悬液放入 900 L 水中，重复一次将菌液稀释为 10-3。用移液枪取 100 L 稀释完的菌液于培养皿上，用涂布器涂匀后再用镊子呈正三角形放入泡完样品风干后的圆形滤纸片，每种菌样都放三片不同浓度的滤纸片，放入 37 培养箱中倒置培养 24 h，观察结果。 4 2.7 半数抑菌浓度的测定 采用带毒平板法 9对金黄色葡萄球菌进行实验，将菌
14、种分别用移液枪取 100 L 菌悬液于 900 L 水的试管中摇匀，再取 100 L 摇匀后的菌悬液放入 900 L 水中，重复两次，将菌液稀释到 10-3 备用。将 3.0 mg/L 的 VcSe 样品按梯度稀释至 2.5 mg/L、2.0 mg/L、 1.5 mg/L、 1.0 mg/L、 0.5 mg/L。然后把稀释好的菌液取 100 L 和每个梯度浓度的样品取出 100 L 混合摇匀后加入培养基，用涂布器涂匀后放入 37 培养箱中培养 24 h，观察结果。 3 实验结果 3.1 菌种稀释度选择的结果 通过平板计数法，根据菌种生长情况、分布均匀程度、分布密度情况，三种菌种都在 10-3
15、这个稀释度有着良好的生长，所以将后续试验稀释度定为 10-3。 3.2 抑菌圈测定结果 采用滤纸片法检测 VcSe 溶胶对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果 ,实验结果如图 3.2-1 所示 VcSe 溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈非常明显，与枯草芽孢杆菌相比较效果会更好，而枯草芽孢杆菌几乎没有出现抑菌圈。 图 3.2-1 不同浓度的 VcSe 溶胶对两种菌的抑菌效果 图 A 为金黄色葡萄球菌 图 B 为枯草芽孢杆菌 3.3 半数抑菌浓度的测定结果 实验对照如图 3.3-1 左图为只加了 200 L 金黄色葡萄球菌菌悬液，右图为培养基未被污染的空白平板。 稀释度为 10-3 时，平板上上培养
16、两天后，生长的金黄色葡萄球菌菌落个数为 71A B 3.0mg/L 2.0mg/L 1.0mg/L 3.0mg/L 2.0mg/L 1.0mg/L 5 个。 图 3.3-1 左图为金黄色葡萄球菌的空白对照 右图为空白平板 通过带毒平板法检测 VcSe 溶胶对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，从 3.3-2 可以看出随着 VcSe 溶胶浓度的增加菌落个数也逐渐减少，通过计算菌落个数，半数抑菌浓度在 1.5 mg/L 左右。 表 2 VcSe 浓度和菌落个数 浓度 空白 0.5 mg/L 1.0 mg/L 1.5 mg/L 2.0 mg/L 2.5 mg/L 3.0 mg/L 个数 71 53 45 34 29 18 9 6 图 3.3-2 VcSe 溶胶浓度梯度的抑菌效果 4 结论 实验选择以枯草杆菌和金黄色葡萄球菌进行对比实验，通过两种菌种的抑菌圈实验和半数抑菌浓度实验评价 VcSe 样品的抗菌能力。 抑菌圈实验部分通过观察抑菌圈直径可以看出 VcSe 样品对金黄色葡萄球菌有明显抑菌效果。 半数抑菌浓度实验中金黄色葡萄球菌与空白对照组进行对比计算菌落个数得出1.5 mg/L 为半数抑菌浓度，且在浓度范围内随着 VcSe 溶胶浓度增加抑菌效果也逐渐增强。实验结果表明， VcSe 对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果。
