1、 本科毕业论文 （ 20 届） 柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定 所在学院 专业班级 食品质量与安全 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘 要 . I Abstract . II 1 绪论 . 1 2 抗氧化性的测定 . 2 2.1 材料和方法 . 2 2.1.1 试剂 . 2 2.1.2 仪器 . 2 2.1.3 实验方法 . 2 2.2 实验结果 . 5 2.2.1 清除羟基自由基 . 5 2.2.2 清除超氧阴离子自由基 . 5 2.2.3 清除 DPPH 自由基 . 6 2.2.4 还原力测定 . 7 2.3 实验小结 . 8 参考文献 . 9 致谢 .11 柠
2、檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定 I 摘 要 抗氧化剂能够清除人体内的自由基而具有延缓衰老、预防疾病的作用 。 因此，筛选高效、稳定、低毒的抗氧化剂具有极其重要的意义。本 试 验选用柠檬酸钠修饰的纳米硒（ CitSeNPs）为研究对象，利用邻苯三酚自氧化法 、 清除羟基自由基法、 DPPH自由基法 、 总还原力法测定 CitSeNPs 溶胶的抗氧化性。结果显示 CitSeNPs 具有很强的清除自由基的能力，其清除能力与浓度呈正相关。其中， CitSeNPs 清除羟基自由基的能力明显大于抗坏血酸；当浓度大于 0.4 mg/mL 时， CitSeNPs 清除超氧阴离子自由基的能力强于抗坏血酸。说明
3、 CitSeNPs 有望成为一种高活性的纳米材料类抗氧化剂。 关键词 ： 纳米硒；柠檬酸钠；抗坏血酸；抗氧化性 柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定 II Abstract Antioxidants can remove free radicals in the human body and have the effect of deferring organism aging and preventing diseases. Therefore, screening efficient, stable, and low toxicity antioxidants has an extremel
4、y important significance. In this study, sodium citrate which modified nano-selenium was used as the object of study. The pyreparens self-oxidation method, the hydroxyl radical scavenging method, the DPPH radical method and the total reducing force method were used to determine the antioxidant activ
5、ity. The results showed that Cit SeNPs had a strong ability to scavenge free radicals, and their scavenging ability was positively correlated with the liquid concentration. The ability of Cit SeNPs to scavenge hydroxyl radicals was significantly higher than that of ascorbic acid. When the concentrat
6、ion was over 0.4 mg/mL, Cit SeNPs has a stronger ability of scavenging superoxide anion radicals than ascorbic acid. All of these results prove that Cit SeNPs is expected to be a kind of highly active antioxidant of nanometers material. Key words : nano-selenium ; sodium citrate ; ascorbic acid ; ox
7、idative stability 柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定 1 1 绪论 人 体在日常代谢过程中会不断产生自由基，包 括羟基自由基 (OH)、过氧化自由基 和 超氧阴离子自由基 (O2-)等 1。这些 自由基 会造成氧化性 的 损伤 ， 破坏人体各个器官 的正常功 能 。通过 维持各游离自由基在体内 的 平衡， 能 有效预防机体细胞免疫力下降、 细胞衰老、心血管病变、 细胞癌变等众多 疾病 2。 因此，适量摄入一些具有抗氧化活性的保健品和药品有利于增强机体的抗氧化能力 3-4 。 当今市面上常见的抗氧化剂 有 :丁基羟基茴香醚 (BHA)、丁基羟基甲苯 (BHT)、特丁基对苯二酚（
8、 TBHQ）等。 但是， 这些抗氧化剂热稳定性差 、 抗氧化效率较低 、有效浓度 范围 比 较狭窄 ，寻找 一种 高效低毒的抗氧化剂成为目前亟待解决的问题。 硒是人体必不可少的微量元素，与人体内多种酶的作用密切相关，在生命过程中起着极其重要的作用。 硒制品（如硒旺胶囊）在保健食品和医药品中占有重要的地位。夏弈明教授在 2009 年的中国硒资源开发与利用研讨会（恩施）上指出：目前硒的摄入量标准是根据满足谷胱甘肽过氧化物酶的活性而制定的，要想真正满足对硒的活性需求，人体还是要靠硒营养品的摄入。然而，作为国际四大抗氧化剂的硒抗氧化效果强，但营养剂量和毒性之间范围比较窄。 纳米硒的出现，解决了硒元素的
9、这一应用难题。纳米硒既没有破坏硒元素在人体内的活性，又确保了硒的高安全性。 硒旺胶囊的问世，实现了纳米硒在人体当中的应用。为了筛选出具有抗氧化活性的纳米硒，进一步实现纳 米硒作为抗氧化剂的应用，本实验选用 以 柠檬酸钠修饰 的 CitSeNPs 溶胶 作为研究对象 5-6，通过清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、 DPPH 自由基 的能力、 还原力测定 这 四种方法来评价其抗氧化能力。 柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定 2 2 抗氧化性的测定 2.1 材料和方法 2.1.1 试剂 2.1.2 仪 器 仪器 生产厂家 FA2104 型电子天平 奥豪斯国际贸易（上海）有限公司 分光光度计 上海元析
10、仪器有限公司 JW-1042 低速离心机 上海安亭科学仪器厂 超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司 数显恒温搅拌循环水箱 常州国华电器有限公司 2.1.3 实验方法 （ 1）羟基自由基清除能力的测定 柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定 3 1） 原理： Fe2+与 H2O2 反应生 成羟基自由基（ OH），由于 OH 化学 性质很活跃 ，存在的 时间 短 ， 水杨酸 可作为 OH 捕捉剂， 水杨酸 与被捕获的羟基自由基反应 生成两种有色的 物质 。通过 测定这两种羟基化合物在 510 nm处 的吸光 度， 可以 间接 得出 样品清除 羟基 自由基能力的 强弱 7-9。 2）方法：借鉴 Z
11、hong 等人的方法 10。测定前用蒸馏水将放置在冰箱中保存的 3 mg/mL 的 CitSeNPs 溶液稀释成不同浓度 :分别为 0.025 mg/mL、 0.05 mg/mL、0.10mg/mL、 0.20 mg/mL、 0.40 mg/mL。 各取 1.0 mL 上述配好的样液于 5 支试管中，按照先后顺序加入 6 mmol/L 的 FeSO4 1.0 mL、 6 mmol/L 的 H2O2 1.0 mL， 混匀后静放 10 min。再加入 6 mmol/L 的水杨酸溶液 1.0 mL，混匀后静置 30 min，最后在 510 nm处测其吸光度值 Ai。其他处理一样的情况下，把 1.0
12、mL 的水杨酸换成蒸馏水，测得吸光度 Aj；把 1.0 mL 的 CitSeNPs 溶液换成 蒸馏 水，测得吸光度 A0。 以 维生素 C 和柠檬酸钠作为阳性对照。 把 各组重复三次的吸光度值取平均值计算清除率： E=（ A0-Ai+Aj） /A0 样品浓度为横坐标，羟自由基清除率为纵坐标，运用办公软件 Excel 2010 作出平均值 标准差的曲线并对曲线进行分析。 （ 2） 超氧阴离子清除能力的测定 1） 原理： 在 溶液呈 碱性 的环境 下 ， 邻苯三酚 会发生 氧化成半醌自由基 ，然后 半醌自由基 再 氧化成醌 的反应，这两步反应都会生成 超氧自由基 11。 溶液呈 弱碱性时 ， 邻苯
13、三酚自氧化速率 随着 O2-浓度 的增大而增大 ， 因此 通过 测定波长为 420 nm处溶液的吸光度值可间接得出 超氧阴离子 （ O2-） 的清除量 12。 2）方法：借鉴 Zhang 等人的方法 13。将 CitSeNPs 溶液稀释成和实验（ 1）相同浓度的样液 。 在 5 支试管中各加入 2.25 mL 的 Tris-HCl（ 50 mmol/L pH=8.2） 溶液，加入 1 mL 的蒸馏水后在 25 oC 下水浴 20 min， 20 min 后先往试管中加入 1mL 上述配好的待测 CitSeNPs 溶液，再加入浓度为 25 mmoL 的邻苯三酚溶液 0.25 mL，充分摇匀后放在
14、 25 oC 的水浴箱中反应 6 min，将其取出后 加入 0.5 mL 10 mmol/L 的 HCl。最后于 320 nm 下测吸光度值 Ai。其他处理不变的情况下， 0.5 mL 的邻苯三酚换成蒸馏水，测吸光度 Aj； 1.0 mL 的 CitSeNPs 溶液换成 蒸馏 水，测吸光度 A0， 以 维生素 C和柠檬酸钠作为阳性对照。 各组重复三次取平均值 。超氧阴离子自由基（ O2-）的清除率： S=（ A0-Ai+Aj） /A0 样品浓度为横坐标，超氧阴离子自由基清除率为纵坐标，运用办公软件 Excel 2010 作柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定 4 出平均值 标准差的曲线并对曲线进
15、行分析。 （ 3） DPPH 自由基清除能力的测定 1）原理： DPPH 自由基是一种稳定的含氮自由基，其 醇溶液 显 紫色 ， 在 517 nm处 有最大吸收 峰 。 当加入抗氧化剂时 ， N 上 的单电子 与其配对，溶液的颜色就会变浅。在 517 nm处的吸光度就会呈一定的线性关系下降。抗氧化能力用清除率来表示，清除率越大，抗氧化性越强。 2）方法：借鉴南等人的 方法 14。测定前将放置在冰箱中保存的 3 mg/mL 的CitSeNPs 溶液取出，用蒸馏水将其稀释成不同 浓度 :分别为 0.00125 mg/mL、 0.0025 mg/mL、 0.005 mg/mL、 0.01 mg/mL
16、、 0.02 mg/mL。 取 1.0 mL 上述已配好的 不同浓度的 CitSeNPs 溶液 于 洁净干燥的 试管中，加入 1.0 mL 0.1 mmol/L 的 DPPH 溶液，充分 摇匀 后避光反应 20 min， 于 517 nm 处测吸光度 Ai，把 1.0 mL 的 DPPH 换成 无水乙醇 ，其他处理一样的情况下测吸光度值 Aj；把 1.0 mL 的 CitSeNPs 溶液 换成蒸馏水，其他处理不变的条件下测吸光度值 A0。 以 维生素 C 和柠檬酸钠作为阳性对照。 各组重复三次取 平均值计算清除率 ： I =（ A0-Ai+Aj） / A0 样品浓度为横坐标， DPPH 自由基
17、清除率为纵坐标，作出平均值 标准差的曲线并对曲线进行分析。 （ 4） 还原力的测定 1）原理：待测 样品的抗氧化性 将 K3Fe(CN)6 还原 K4Fe(CN)6， K4Fe(CN)6 再 和 FeCl3反应 ，生 成在 700 nm 处有最大吸 收峰 的普鲁士蓝 (Fe4Fe(CN)63)。 一般来说，溶液的吸光度越大，表明还原能力也越强，因 此 可以通过反应后的溶液在 700 nm 处吸光度值的大小来间接得出该抗氧化剂还原力的大小。 2）方法： 借鉴顾彩琴等人的 方法 15-16。测定前将放在冰箱中保存的 3 mg/mL 的CitSeNPs 溶液取出， 稀释成和实验（ 1）相同浓度的样液
18、 。 准确移 取 1.0 mL 上述已配好的 不同浓度 的 CitSeNPs 溶液于 洁净干燥的 试管中，加入 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液 1.25 mL (pH=6.6)和 1%的铁氰化钾溶液 1.25 mL， 充分摇匀后放置在温度为 50 oC 的恒温水浴箱中 保温 20min，接着取出用流动的自来水使其 快速冷却 ， 加入 1.0 mL 10%的 三氯乙酸 ， 3000 r/min 的转速离心 10 min， 取 0.5 mL 上清液 ， 加入 0.1%的三氯化铁溶液 0.25 mL， 再移取 1.75 mL 的 蒸馏水， 充分混匀后 在 吸光度为 700 nm 处测定其吸光 度
19、A。 以 维生素 C 和柠檬酸钠 作 为 对照 ， 各组均按上述方法重复测量三次，记录吸光度值为 A。 作出。 最后运用办公软件 Excel 2010 画出吸光度与浓度之间的关系曲线，柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定 5 结果用 平均值 标准差表示，并对曲线进行分析。 2.2 实验结果 2.2.1 清除羟基自由基 维生素 C、柠檬酸钠、 CitSeNPs 对超氧阴离子自由基清除效果如图 1 所示。 结果显示，三者的清除率均随 样液 浓度的增大而增大 。 特别的是 CitSeNPs 的清除效果明显高于其他两者 ， 当浓度达到 0.4 mg/mL 时， CitSeNPs 的清除率可达到 96.8
20、5%，而 维生素 C 和柠檬酸钠分别为 78.45%和 61.18%。 说明 CitSeNPs 清除羟 基 自由基的能力强于 维生素 C 和修饰剂 柠檬酸钠。 图 1 维生素 C、柠檬酸钠、 CitSeNPs 对 羟自由 基的清除率比较 2.2.2 清除超氧阴离子自由基 维生素 C、柠檬酸钠、 CitSeNPs 对超氧阴离子自由基清除效果如图 2 所示。 结果显示， 维生素 C 和 CitSeNPs 对自由基的 清除率 与浓度呈正相关， 柠檬酸钠清除自由基的能力几乎不随浓度的变化而变化。此外，当浓度大于 0.4 mg/mL 时， CitSeNPs0204060801001200 0.1 0.2
21、 0.3 0.4 0.5清除率（%）浓度（ mg/mL） 维生素 C 柠檬酸钠 CitSeNPs柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定 6 对超氧阴离子的清除率的能力与维生素 C 基本相同 ，分 别为 97.49%和 97.27%，而柠檬酸钠的清除率基本都保持在 4%左右。 图 2 维生素 C、柠檬酸钠、 CitSeNPs 对超氧阴离子 自由 基清除率比较 2.2.3 清除 DPPH 自由基 维生素 C、柠檬酸钠、 CitSeNPs 对 DPPH 自由基 的清除效果如图 3 所示。 结果显示， 维生素 C 和 CitSeNPs 对自由基的 清除率 与浓度呈正相关，且在样液的浓度很低时就体现出较好的清除能力，而柠檬酸钠基本 没有清除 DPPH 自由基的能力。 当溶液浓度为 0.02 mg/mL 时， CitSeNPs 对 DPPH 自由基的清除率为 74.03%，维生素 C为 93.56%。 0204060801001200 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5清除率（%）浓度（ mg/mL） 维生素 C 柠檬酸钠 CitSeNPs
