1、 本科毕业论文 （ 20 届） 维生素 C 修饰的纳米硒 抗氧化性研究 所在学院 专业班级 食品质量与安全 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目 录 摘要 . I Abstract. II 引言 . 1 1 材料 . 2 1.1 试验材料 . 2 1.2 试验 试剂 . 2 1.3 试验 仪器 . 2 2 试验溶液配制 . 2 3 试验方法 . 3 3.1 清除羟自由基 的 能力测定 . 3 3.2 清除 超氧阴离子 自由基的 能力测定 . 3 3.3 清除 DPPH 自由基 的 能力测定 . 4 3.4 还原 能 力的测定 . 4 4 结果与讨论 . 4 4.1 清除羟自由基
2、 的 能力测定 . 4 4.2 超氧阴离子 清除 能力的测定 . 5 4.3 清除 DPPH 自由基能力的测定 . 6 4.4 还原 能 力的测定 . 6 5 结论 . 7 参考文献 . 8 致谢 . 9 维生素 C 修饰的纳米硒抗氧化性研究 I 摘要 试验 通过测定 维 生素 C 修饰的纳米硒（ VcSeNPs） 清除羟自由基、超氧阴离子、DPPH 自由基的能力以及还原能力，评价其抗氧化活性。结果 显示 ，在 试 验所选择的浓度范围内， VcSeNPs 对自由基的 清除率 及还原力 均随着浓度的增大而增加。 其中，VcSeNPs 对 O2-、 DPPH 及 OH 自由基 清除率 与 Vc 接
3、近，而浓度超过 0.4 mg/mL 时，其 还原力 略 大于 Vc。 试 验结果 表明 ， VcSeNPs 具有抗氧化作用。 关键词 ： 维生素 C 修饰的纳米硒 （ VcSeNPs） ； Vc； 抗氧化性 维生素 C 修饰的纳米硒抗氧化性研究 II Abstract This experiment measured four indicators of vitamin C- modified nano-selenium (VC SeNPs): ability of removing hydroxyl radicals; competence of scavenging free radica
4、ls; ability of eliminating DPPH free radicals and reducing capacity, so that the antioxidant activity was evaluated. The results showed that those four aspects were increased as the concentration of VC SeNPs augmented. Besides, there are small differences between VC SeNPs and VC according to their c
5、ompetence of scavenging O2-,DPPH andOH. While the concentration of those does was more than 0.4 mg/mL, the reducing force of VC SeNPs was slightly greater than that of VC. Thus, this resules indicated that VC SeNPs had antioxidant properties. Keywords: vitamin C-modified nano-selenium(VcSeNPs);vitam
6、in C;resistance to oxidation 维生素 C 修饰的纳米硒抗氧化性研究 1 引言 纳米硒 作为 一种新研 发出的产 品， 可以 发挥硒的 生物学 和 保健 功 效 。 它 所 具 备的低毒性 尤为关键 。 2000 年，上海四通纳米技术有限公司将纳米硒产业化。获国家卫生部批准制成保健食品 -硒旺胶囊 1。 2003 年，陈君石院士指导进行亚慢毒性研究实验，其结果证明，纳米硒是最安全的硒制品，可长期食用 2。 这些优势使得纳米硒成为研究热点。 抗氧化剂 可以延长食物的存储期， 防止氧化， 增强 其稳定性。 在油脂中添加 部分抗氧化剂如异抗坏血酸和 维生素 C 能够避免油脂
7、氧化。其作用 机理为， 利用抗氧化剂还原力，降低含氧量 。 抗氧化活性是纳米硒 的 重要生物活性 之一 ，主要表现在纳米硒能够通过清除自由基对细胞进行保护，防止细胞被损伤和发生癌变 3。 Vc 是人体需要量最大的一种维生素， 并且可以 作为抗氧化剂 在体内发挥其作用 ， 其能够使 体内的一些自由基 和 活性氧基团 消除 ， 防止细胞因为被氧化而发生侵害 、 加强 对铁 元素 的吸收、 并且提高机体的免疫 能力 、 降低 癌 症的病发率 等。 试 验 所选用的 维 生素 C 修饰的纳米硒 （ VcSeNPs） 具有很好的稳定性，然而，对 VcSeNPs 的抗氧化能力测定目前未被研究到。 试 验通
8、过测定 VcSeNPs 对还原能力以及超氧阴离子、羟自由基、 DPPH 自由基的清除能力，对 VcSeNPs 的抗氧化性能进行 评价 ，从而进一步探究纳米硒的生物功能，为纳米硒在保健食品等行业的发展提供理论依据。 维生素 C 修饰的纳米硒抗氧化性研究 2 1 材料 1.1 试验材料 ： 维 生素 C 修饰的纳米硒 （ VcSeNPs） 1.2 试验 试剂 ： 1.3 试验 仪器 ： V5600 型分光光度计 北京长安科学仪器 FA2104V 型电子天平 上 海青浦仪器有限公司 JW-1042 低速离心机 上海安亭科学仪器厂 HH-66 数显恒温搅拌循环水箱 上海安亭科学仪器厂 超声波清洗机 宁
9、波新芝生物科技股份有限公司 2 试验溶液配制 1) 9 mmol/L 水杨酸（用无水乙醇进行配制）：称取 0.12 g水杨酸，用无水乙醇进行溶解并移至 100 mL 容量瓶，并定容至刻度。 2） 9 mmol/L FeSO4：称取 0.14 g FeSO4，用蒸馏水对其进行溶解并移至 100 mL 容量瓶，再用蒸馏水定容至刻度。 维生素 C 修饰的纳米硒抗氧化性研究 3 3） 8 mmol/L H2O2： 移取 100 L 30%的 H2O2 至 100 mL 容量瓶中，蒸馏水定容 至刻度 。 4） 0.1 mmol/L DPPH（用无水乙醇进行配制）：称取 0.004 g DPPH，用无水乙
10、 醇对其进行溶解并移至 100 mL 容量瓶，最后用无水乙醇定容至刻度。 5） 50 mmol/L（ pH=8.2） Tris-HCl缓冲液： 称取 0.61 g Tris，用 蒸馏水溶解、移至 100 mL 容量瓶，用盐酸调 pH，最后用蒸馏水定容至刻度。 6) 25 mmol/L 邻苯三酚： 称取 0.16 g邻苯三酚 ,蒸馏水对其进行 溶解并移至 50 mL 的容量瓶，定容至刻度。 7) 0.2 mol/L（ pH=6.6）磷酸盐缓冲液 ： 分别先配制 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液，而后分别取上述溶 40 mL 和 60 mL 混合后就是 0.2 mol/L pH=
11、6.6 的磷酸盐缓冲液。 称取磷酸二氢 钠 1.74 g，磷酸氢二钠 2.70 g，氯化钠 1.70 g，蒸馏水溶解成 400 mL。 8) 1%铁氰化钾： 称取 1 .00 g铁氰化钾 ,加水 99.00 g，混匀即可。 9) 10%三氯乙酸： 称取 10 .00 g三氯乙酸 ,加水 90.00 g，混匀即可。 10) 0.1%三氯化铁： 称取 0.10 g三氯化铁 ,加水 99.90 g，混匀即可。（实验所用水均为蒸馏水） 3 试验方法 3.1 清除羟自由基 的 能力测定 用移液枪准确量 取 0.5 mL 不同浓度 的 VcSeNPs 于试管中 ， 先后 加入 0.5 mL 9 mmol/
12、L FeSO4 和 0.5 mL 8.8 mmol/L 过氧化氢 ， 轻轻振荡混合后放 置 10 min， 最后每只试管分别 加入 0.5 mL 9 mmol/L 水杨酸， 轻轻振荡混合后放 置 30 min， 在 510 nm 处测吸光度 Ai。 将 水杨酸 替换为蒸馏水 测 其 吸光度 Aj， 0.5 mL 的 蒸馏水 为参比做对照，测 其 吸光度 A0。 每 组重复测 量 三次，取 其 平均值 。 用 Vc 溶液 做阳性对照 。 羟自由基清除率 E 的计算公式为 ： E =A0 -（ Ai-Aj） /A0 3.2 清除 超氧阴离子 自由基的 能力测定 用移液枪准确量 取 0.9 mL 5
13、0 mmol/L pH = 8.2 的 Tris-HCl缓冲液 、 0.4 mL 蒸馏水维生素 C 修饰的纳米硒抗氧化性研究 4 于试管中 ， 25 水浴 中反应 20 min， 然后用移液枪分别量 取 0.4 mL 不同浓度 的VcSeNPs、 0.1 mL 5 mmol/L 邻苯三酚 于每支试管中 ， 用手轻轻振荡使其均匀混合 ,在 25 水浴中反应 6 min， 迅速移取 0.2 mL 10 mmol/L 盐酸 结束反应 ，在 320 nm 处 测其 吸光值 Ai， 将 邻苯三酚 替换为蒸馏水 测 其 吸光度 Aj， 0.4 mL 蒸馏水 为参比做对照 ，测 其 吸光度 A0。 每 组重
14、复测 量 三次，取 其 平均值 。 Vc 溶液 做对照 。 超氧阴离子自由基清除率 S 的 计算 公式为 ： S =A0 -（ Ai-Aj） /A0 3.3 清除 DPPH 自由基 的 能力测定 用移液枪准确量 取 1.0 mL不同浓度的 VcSeNPs 和 0.1 mmol/L 的 DPPH溶液 1.0 mL 于试管中轻轻振荡使其混合均匀， 避光 条件下 反应 20 min， 在 517 nm 处测 其 吸光度 Ai， 将 DPPH 替换为无水乙醇 ，测吸光度 Aj；以蒸馏水 为参比做对照 ， 测 其 吸光度A0。 每 组重复测 量 三次，取 其 平均值 。 用 Vc 溶液 做阳性对照 。
15、计算清除率 I： I =A0 -（ Ai-Aj） /A0 3.4 还原 能 力的测定 用移液枪准确量 取 1.0 mL 不同浓度的 VcSeNPs， 并分别移取 1.25 mL 的 pH = 6.6 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液 和 1%的铁氰化钾溶液 于离心管中 ， 轻轻振荡混合后 ， 在50 水浴中 反应 20 min， 迅速降至室温 ， 移取 10%的 三氯乙酸 1.0 mL于每支离心管中 ，3000 r/min的 速度下 离心 10 min。 移 取 0.5 mL 上清液， 并分别移取 1.75 mL 蒸馏水 和0.25 mL 0.1%的三氯化铁溶液 于试管中 ， 振荡混合后 ，在
16、 700 nm 处测其吸光值 Ai。 用Vc 溶液做 阳性对照。 4 结果与讨论 4.1 清除羟自由基 的 能力测定 据前人研究， OH 具有较强的氧化性，基本上可以和全部细胞成分发生反应，且反应速率很快。硫酸亚铁 与 过氧化氢能够 反应 形 成羟自由基， 而 水杨酸 的加入将 会 使其生成 有色物质，在 510 nm处有最大吸收 。 抗氧化剂添加后将 与水杨酸 争夺 羟自由基，维生素 C 修饰的纳米硒抗氧化性研究 5 淡化其 颜色或 使其 消失， 以此 判定其 对 羟自由基的 清除 能力。 样品液 VcSeNPs 和VC对 OH 的清除率 如图 1 所示 ： 在浓度范围之内 样品液 和 VC
17、对羟自由基的清除率随浓度的增大而增加； 0.6 mg/mL 浓度下， VC对 OH 的 最大 清除率 接近 85%；样品 对 OH的清除率略低于 VC， 清除率为 78.44%。 图 1 VC和 VcSeNPs 对 OH 清除率 的比较 Fig.1 Comparison of VC and VcSeNPs forOH Scavenging 4.2 超氧阴离子 清除 能力的测定 邻苯三酚在 Tris-HCl 缓冲液（ pH=8.2）中会发生自氧化反应，期间伴有 O2-和有色的中间产物，该有色的中间产物在 320 nm处有特征吸收 。 加入自由基清除剂 即 可 阻抑产生中间产物和超氧阴离子 ， 以
18、此淡化颜色 ， 减小 吸光度 。 因此能够 通过吸光度的变化， 判定对 O2-自由基的 清除 能力。 VcSeNPs 和 VC对超氧阴离子自由基的清除率如 图 2 所示 ： 在 0.1-0.3 mg/mL 浓度范围内， VC对 O2-的清除率随着浓度的增大迅速增大，之后随着浓度的增大略有增大但变化不大；而样品溶液对 O2-的清除率在 0.1-0.6 mg/mL 范围内随浓度的增加而增加，最高可达 96.78%。样品对 O2-的清除率均低于同浓度下 VC对 O2-的清除率。 维生素 C 修饰的纳米硒抗氧化性研究 6 图 2 VC和 VcSeNPs 对 O2-清除率 的比较 Fig.2 Compa
19、rison of VC and VcSeNPs for O2-Clearance 4.3 清除 DPPH 自由基能力的测定 DPPH 自由基结构中 的 单电子，在乙醇中显 现 深紫色，是一种稳定的含氮自由基，在 517 nm处有特征吸收 。 抗氧化剂 的加入 ， 可使其 氢与 DPPH 结合， 导致 颜色 产生 变化 ，吸光 度 也 相应的发生 变化， 以此 评价 对 DPPH 自由基 的清除 能力。 VcSeNPs 和VC 对 DPPH 自由基的清除率 如 图 3 所示 ： VC 对 DPPH 自由基清除作用 较强 。 在0.001-0.004 mg/mL 浓度内， VC对 DPPH 的清除率迅速增加，之后随着浓度的增加基本上无太大变化；而样品的清除率在 试 验浓度范围内随着浓度的增大而增大， 呈量效关系，清除率最高 可 达 56.91%， 且清除率均低于同浓度下 VC对 DPPH 自由基的清除率 。 图 3 VC和 VcSeNPs 对 DPPH 自由基清除率的 比较 Fig.3 Comparison of DPPH Free Radical Scavenging Rate with VC and VcSeNPs
