1、IH复习提纲,一、课程性质及特点 免疫组织化学是一门研究利用核素或非核素标记物作为显示手段，并借助免疫化学或亲合化学的专一性和高灵敏性，原位示踪组织或细胞中的抗原或抗体的应用科学，是一项敏感、特异的原位示踪染色技术。 特点：特异、敏感（ng或pg水平），原位、形态-机能-代谢三位一体。,二 、技术类型 IH的技术类型多样，彼此通用，各有特点。（1）以标记物种类分：放射免疫自显影，免疫荧光、免疫酶标、亲合免疫酶标、络合放大免疫酶标（CSA 、 Epos 、 EnVision 、 UIP） 、 免疫重金属标记（胶体金、铁蛋白）等 。,（2）以标记物交联特点分：标记抗体（直接法和间接法）、不标记抗体
2、（桥法和复合物法）。（3）以显示敏感度分；单标记、重复标记（双PAP、PAP-ABC法等）、网络标记（EnVision、CSA法等）。,目前应用较广且较为敏感的技术有PAP、S-P、sABC、IGSS（间接法）和EnVision法等。一般来说，免疫光镜多采用S-P（间接法）、sABC法-HPO、IGSS法（间接法）和EnVision（间接法）；免疫电镜多采用IGS法（间接包埋后）。,三、免疫试剂 IH的关键试剂为抗体：计有特异性抗体（第一抗体-示踪试剂）、桥连抗体（第二抗体-放大试剂）和标记抗体（第三抗体、-显示试剂）等。目前商品化的各种抗体试剂多为鼠系单克隆抗体，应用中必需注意种系匹配和免疫
3、学亲和对应原理。,四、组织处理和切片选择免疫组织化学中组织处理的原则是“ 保留抗原、维护结构”；操作中注意“ 及时固定、温和短时”；“ 石蜡优先，冰冻跟上”；“ 暴露决定簇，阻断内源干扰”。,常用于石蜡包埋组织固定剂有：10中性甲醛、4缓冲多聚甲醛、PLP液等。 载玻片做到清洁、无尘、防脱片（预涂粘片白胶-10%或多聚赖氨酸0.05%或3-氨丙基三乙氧硅烷2）。,五 、 方法原理与选择根据免疫组化染色方法类型众多，基本原理大同小异，但由于标记交联显示方法的不同，其技术的检测敏感性上存在某些差异，可按工作实际与实验室条件，加以选用。,目前文献中仍以酶标记应用报道最多，尤其是与亲合物的结合。例如L
4、sABHPO间接法(或称SP 间接法 ），sABC-HPO法，LsAB-AKP法， sABC -AKP法，其次是PAP法或APAAP法，IGSS间接法。 免疫荧光间接法尚有一定应用价值，仍可见于诸文献报道。免疫胶体金间接法（5nm或10nm）主要应用于免疫电镜。,新近，为了适应快速IH诊断的需要，采用高分子葡聚糖作交联载件，预先连接标记酶和抗体，组成巨大免疫示踪试剂分子，使免疫组化染色操作流程大大简化和标准化，并由于检测复合物的分子量的增大而进一步提高了方法的灵敏度。该类增敏放大方法有多种，其中以EnVision法的应用报道 最多，并已有商品试剂供应。,酶标亲合素（sA）生物素（B）化二抗一抗
5、Ag,sA,HPO,AKP,LsA-AKPb-Ab2Ab1Ag,LsAB-HPO（间接法）,LsAB-AKP（间接法）,ABC-HPOb-Ab2Ab1Ag,B,ABC-AKPb-Ab2Ab1Ag,sABC-HPO sABC-AKP法,PAPAb2Ab1Ag,APAAPAb2Ab1Ag,PAP法 APAAP法,银显影G Ab2Ab1Ag,S,G,Ab2-荧光素（FITC）Ab1Ag,IGSS（间接法）,IF（间接法）,EnVision(葡聚糖)酶(HRP或AP)标抗体间接法,标记第二抗体葡聚糖酶络合物,特异性抗体(一抗),CSA酶催化生物素化酪胺级连放大法,b,级联放大的酶标记，SAB酪胺抗原抗
6、体免疫复合物,生物素化酪胺基团,链霉亲合素标记酶(HRP或AP),生物素化二抗,特异性抗体(一抗),方法选择可根据检测抗原的量与脆性而定，抗原含量高，抗性强则允许选择放大效率低的染色法（如间接法），若抗原含量少，脆性大的膜抗原或微量抗原则多选择复合物法或亲合标记法，甚至在底物显色反应前重复免疫操作流程，以进一步提高染色方法的灵敏度，降低检测阈值，如双PAP法、双APAAP法、PAPABC法等。,目前多选用微波修复的聚合物或络合物免疫标记（如EnVision-HPO法、CSA法等）。 酶标记方法的灵敏度由高到低依次为：EnVision-HPO、S-P、ABC、PAP、酶标抗体间接法。,免疫电镜则
7、多选择电子密度高的IGS间接法。采用包埋前法需注意改善细胞膜的穿透性，包埋后法则强调抗原的保护，前后固定剂选择要求温和、短时、有效，必要时可不用锇酸后固定或铅铀复染。 显色剂与标记酶要专一，应用中还需注意试剂的溶解特性，正确选择封片方式。,六 、对照染色与结果判定 对照染色设置是IH中十分重要 和 关键的一项操作，它涉及IH染色结果的正确判定和假阳性，假阴性异常错误结果的识别。,常用的免疫组化的对照，有阳性组织对照、阴性组织对照，阴性试剂对照（主要是特异性抗体）和自身组织对照。其中以阴性试剂对照最为重要，包括有：,（1）空白对照（省去一抗或用PBS或TBS替代）；（2）替代对照（用动物正常血清
8、或无关抗体替代特异性一抗）；（3）吸收试验对照（用事先经过量抗原吸收过的一抗上清液染色）；（4）竞争或抑制试验对照（用一定比例混合的标记抗体和未标记抗体的试剂染色）,预实验，特别是稀少抗原的检测，首创性的研究工作，阴性试剂对照的类型尽可能多选做几种，以说明实验结果和所用试剂的特异性和可靠性。正式实验为节省工作量，可只做空白对照，而且需与实验切片同步操作，其结果必需是阴性。,*附：原位PCR 一般常用间接法即先行PCR核酸扩增，后再做ISH的原位显示核苷酸方法 ，其技术原理和操作要求基本上同一般原位分子杂交，但灵敏度更高，对照要求更严。,其对照设置除要求用不含探针的预杂交液替代特异性杂交液的空白
9、对照外，还要做核酸酶（DNA酶或RNA酶）消化后的阴性对照，必要时还要做质粒或正义RNA探针的替代对照，以排除假阳性或假阴性的干扰。,七 、 IH的质量要求 （1）特异染色鲜明、清晰，背景本底较弱，二者反差明显，比值1。 （2）阳性显色定位正确。 （3）对照染色结果附合要求，阴性试剂对照必需是阴性结果。,八 、增强特异性染色抗原或信号丢失，其次是方法灵敏度不足 特异性染色结果不佳或缺如（阴性）的主要原因是组织处理不当 ，或试剂，操作不当，底物陈旧等。,增强特异性染色的措施一般有： （1）延长染色孵育时间，特别是一抗。 （2）多重孵育反应（即重复主要操作流程）。 （3）降低背景（洗涤或稀释缓冲液
10、中加入0.21 Triton-100或1BSA；10正常血清或1BSA预孵育等）。,（4）提高组织细胞的通透性（如冻融、提高稀释缓冲液的离子浓度和渗透压等）。 （5）微波修复或蛋白酶预消化。假阴性是指阳性组织对照呈现阴性的实验切片阴性结果。, 九 、非特异性染色背景 凡非属靶抗原与其特异性抗体结合反应引起的标记显色或荧光，均称为非特异性染色，又称背景染色。原位PCR或原位分子杂交染色中的非特异信号或称本底，则指非属特异性探针与靶序列碱基配对所产生的杂交信号。,非特异染色或信号是IH或IS- PCR 产生假阳性结果的主要原因，产生的因素很多，包括来自组织细胞本身，标记物或探针及试剂的质量，操作失
11、误等。降低非特异染色背景或本底的措施有：,（1）清除血清中未结合的游离荧光素，聚合物或杂抗体;（2）组织切片用正常动物血清（或BSA）预孵育阻断非特异性反应位点或特异性抗体试剂中混杂的白蛋白抗原（不洗）; （3）阻断内源酶活性或其它内源物干扰;（4）提高第一抗体的稀释度和相对延长孵育反应时间;,（5）选用IgG的片段（Fab等）作免疫试剂（避免体内Fc受体的干扰）;（6）提高洗脱缓冲溶液的离子强度（如内含0.5M Nacl，pH8.6缓冲液洗涤）;（7）用0.1mg/ml NaBH4预处理切片10min（去除甲醛色素干扰）;（8）底物显色剂（如DAB/H2O2）临用前新鲜配置：过滤（避免氧化物
12、沉积干扰）。 假阳性是指阴性试剂对照出现阳性的实验切片阳性。,十 、标准化应用目前，IH染色技术已广泛应用于研究和外检病理诊断，但实施中随意性太大，操作欠规范，方法标准各异，判断认识尺度不一，有待统一和标准化。应用中需在下列问题得到统一和标准化：,（1）具有不可替代的地位。（2）合理使用和选择抗体或探针引物，避免无目的滥用。（3）抗原修复的应用，应确定最佳条件，并持慎重态度。（4）对照的严格设立，空白对照或核酸酶消化对照不能省，必要时增加其它对照，同步进行。,（5）结果判断应客观，得有统一标准。（6）实验条件应标准化（参照文献或试剂盒说明书）。（7）预实验证实所用试剂、稀释浓度、染色操作，以及样本的可靠性，稳定实验流程，集中进行正式试验。,
