1、 本科毕业论文 （ 20 届） 化学 小分子 化合物 ZXF1-5-10 对 人肺腺癌 A549 细胞的 作用 所在学院 专业班级 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 山东大学本科毕业设计论文 目录 摘要 . 1 关键词 . 1 ABSTRACT. 1 Key words . 2 缩略词表 . 3 1. 前言 . 4 1.1 肺腺癌 . 4 1.2 靶向位点 . 4 1.3 自噬与癌症 . 5 1.4 化学遗传学 . 6 1.5 小分子的荧光特性 . 6 1.6 肺腺癌上皮细胞 A549 细胞系 . 7 2.材料和方法 . 7 2.1 材料 . 7 主要溶液及试剂配方 （见附录）
2、 . 7 主要仪器设备（见附录） . 7 实验材料 . 7 实验试剂及耗材 . 7 2.2 方法 . 8 细胞的复苏与冻存 . 8 A549 细胞培养与传代 . 8 细胞形态观察 . 8 观察小分子的荧光发光情况 . 9 SRB 法检测细胞存活率 . 9 LDH 试剂盒检测乳酸脱氢酶含量 . 10 Hoechst33258 染色检测细胞凋亡 . 10 AO 染色检测细胞自噬 . 10 统计学分析 . 10 3. 实验结果 . 11 小分子化合物结构式 . 11 小分子化合物对细胞形态的影响 . 11 小分子化合物的荧光发光情况 . 11 小分子化合物对细胞存活率的影响 . 11 小分子化合物处
3、理细胞后上清液 LDH 水平 . 11 小分子化合物处理细胞后 Hoechst33258 染色情况 . 11 小分子化合物对细胞内酸性膜泡积累量的影响（ AO 染色情况） . 12 4.讨论 . 12 实验中可能对结果产生影响的因素 . 12 细胞密度 . 12 时间点的选择 . 12 思考与展望 . 13 细胞自噬检测 . 13 山东大学本科毕业设计论文 小分子荧光实验 . 13 细 胞程序性坏死与肿瘤 . 14 5.结论 . 14 参考文献 . 16 谢 词 . 18 附录： . 19 实验数据 . 19 主要溶液及试剂配方 . 23 翻译 . 26 原文 . 26 译文 . 34 山东大
4、学本科毕业设计论文 1 化学 小分子 化合物 ZXF1-5-10 对 人肺腺癌 A549 细胞的 作用 摘要 肺腺癌属于非小细胞肺癌。其早期症状不明显，往往发展到晚期才能被检测出来，手术或是传统的化学疗法都已无力回天，更不用说其副作用。寻求早期诊断的方法或是高效特异抗耐药的治疗手段迫在眉睫。就治疗来说，人们把目光投向新型抗癌 药的研发上。癌细胞往往具有特异的 细胞生长或死亡的信号介导通路，也通常作为研发抗癌药的切入点。本研究从化学遗传学角度出发， 探究人工合成的新型荧光化学小分子罗丹明类衍生物 ZXF1-5-10 对人肺腺癌 A549 细胞的影响，评价其是否具有应用价值。结果表明该化合物具有与
5、五氟尿嘧啶相似的，抑制 A549 细胞生长的效果。根据 Hoechst33258 和 AO 的染色结果推断它可以诱导 A549 细胞产生凋亡和自噬，因此该化合物具有一定的药物开发的潜力。 关键词 A549 细胞 系 靶向治疗 细胞凋亡 细胞自噬 罗丹明衍生物 ABSTRACT The lung cancer is the most common cancer in terms of its incidence and mortality worldwide. There are two primary main types of it: the smell cell lung cancer(S
6、CLC) and the non smell cell lung cancer(NSCLC). The lung adenocarcinoma, belongs to the NSCLC, almost all patients are diagnosed in advanced stage since it does not have any obvious symptoms in early stage. Tumor of this stage can barely operated and traditional chemotherapy does not work either, le
7、t alone the side effect they brought up. So it is urgent to work out an effective detecting method or develop some selective anti-cancer agents. It is a good choice to take advantage of cancer characteristic proliferation or death signal pathway for medicine development. Tests， based on chemical gen
8、etic， were performed， to detect how synthesized nevel fluorescent chemical small molecule Rhodamine Derivatives effected the A549 cell line and to assess the value of this small molecule for medicine application. The results showed that the compound can inhibit the proliferation of the A549 cell wit
9、h a similar effect as 5-fluorouracil. According to Hoechst33258 and AO staining， the 山东大学本科毕业设计论文 2 small molecule might induce apoptosis and autophagy. All these demonstrated that this small molecule might be used as an inhibitor to A549 cell proliferation by inducing cell apoptosis and autophagy.
10、Key words A549 cells Targeted therapy Apoptosis Autophagy Rhodamine Derivatives 山东大学本科毕业设计论文 3 缩略词表 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 PBS phosphate buffer solution 磷酸缓冲液 SRB sulforhodamine B 磺基罗丹明 B DDW deuterium depleted water 超轻水 TCA Trichloroacetic acid 三氯乙酸 LDH Lactic/Lactate dehydrogenase 乳酸脱氢酶 AO
11、acridine orange 吖啶橙 LC3 Microtubule-associated protein light chain 3 微管相关蛋白轻链 3 山东大学本科毕业设计论文 4 1.前言 1.1 肺腺癌 就发病率和致死率来说，肺癌是世界上最普遍的癌症。肺癌主要包括小细胞肺癌 （ SCLC）和非小细胞肺癌（ NSCLC），肺腺癌是病理组织学上最常见的非小细胞肺癌。虽然过去的数十年科学已有了突飞猛进地发展，但研究人员仍不能确定这种癌症的病因。其次这种癌症初期症状不明显，患者很难得到及时的诊断（ 2/3的肺癌患者在 确 诊时已是晚期 ： 期或期 ），同时它还是一种预后不良的恶性肿瘤。 1
12、通常癌症晚期已经不能像早期那样可以通过手术切除而取得良好的治疗效果，取而代之的是采用系统性的化学疗法，但传统上的化疗并不具有癌细胞特异性，在治疗的同时会给患者带来各种不同程度的毒副作用。据报道，即使采取这样的治 疗手法，大部分患者也只能维持不到两年的生命。 2研发毒副作用小，癌细胞特异性强的靶向治疗药物迫在眉睫。 1.2 靶向位点 恶性肿瘤的无限增殖可由细胞信号在传导中发生障碍或异常而导致。通常来讲癌细胞往往具有特异性介导生长和死亡的信号通路。细胞信号转导的靶点，也就是靶向治疗的药物作用位点包括蛋白构象、配基受体结合信号蛋白以及细胞信号转导过程中的关键酶等。 3例如： 糖酵解过程中的酶：很多肿
13、瘤细胞都具有瓦氏效应（增加对葡萄糖的吸收，并提高糖酵解的水平，并认为癌细胞由于线粒体功能的丧失通过糖酵解作用，取代正常的 有氧呼吸为细胞提供能量，后来也有学者证明功能线粒体的存在，糖酵解产生的能量主要用于细胞增殖的原料氨基酸，核糖和脂质的生成，但争论并不影响该靶点的应用） 有报道，将抗坏血酸（ Ascorbic acid， AA）与糖酵解抑制剂联合用药以 ROS 依赖的形式诱导细胞凋亡。联合用药的优势在于，在保持正常细胞较低的影响下，抑制能力高于单独用药，且同时克服了两种药单独使用的缺1 Suryanto A et al. Comparison of Tumor Density by CT S
14、can Based on Histologic Type in Lung Cancer Patients. Acta Med Indones. 2005, 37(4):195-198. 2 Siegelin M D, Borczuk A C. Epidermal growth factor receptor mutations in lung adenocarcinomaJ. PATHOBIOLOGY IN FOCUS, 2014(94):129-137. 3 邱冬梅 , 陈莉 . 细胞自噬：病理学研究的新热点 J. 临床与实验病理学杂志 , 2012(3):309-312. 山东大学本科毕业
15、设计论文 5 点。 表皮生长因子受体 （ EGFR）：属于酪氨酸激酶受体家族， 在上皮源性的多种肿瘤上皮细胞内 EGFR 都有较高的表达。 4既往多种研究结果显示， 在包括肺腺癌 在内的很多癌症都通过 EGFR 通路使细胞具有无限增殖的能力， 阻断 EGFR 、抑制受体酪氨酸激酶（ TK）的活性抑制肿瘤细胞的无限增长也可以阻止癌细胞向周围组织的扩散 ，所以 EGFR 是肿瘤分子靶向治疗的重要靶点之一 5。由 勃林格殷格翰公司研发 的 Afatinib（ 阿法替尼 )，作用为一种 不可逆双重 EGFR-HER2 阻滞剂 ，它不仅可以阻断 TK 的活性，还能很好地克服肿瘤细胞的耐药性。 6 1.3
16、 自噬与癌症 同时一些抗肿瘤药以细胞自噬性死亡的形式达到抑制肿瘤生长的目的。 值得注意的是自噬对癌症具有双重作用， 一方面，自 噬可抑制肿瘤的发生 。 首先，自噬可清除受损 或功能异常的 细胞器 （包括线粒体在内，即线粒体自噬） 以避免ROS 蓄积 导致 突变的发生。 7说明一些细胞由于自噬功能的消失或异常会导致细胞癌变的发生。 另一方面， 自噬可以促进肿瘤的生长。当癌细胞处于代谢性应激或是饥饿环境中时，可通过 自噬限制细胞 死亡或是为细胞增殖提供营养，从而使癌细胞得以存活生长。 8（当然利用这一性质也可以抑制肿瘤，例如研究人员将自噬抑制剂与五氟尿嘧啶联合用药，可克服肿瘤耐药性诱导肿瘤细胞走向
17、凋亡。9）同时某些肿瘤 细胞 会保留 较高的自噬活性 ，作为 肿瘤转 移中细胞脱离细胞外4 Sibilia M， Kroismayr R， Lichtenberger BM， et al The epidermal growth factor receptor: from development to tumorigenesis J Differentiation 2007， 75( 9) : 770-787 5 Hirsch FR， Varella-Garcia M， Cappuzzo F Predictive value of EGFR and HER2 over -expression
18、in advanced non-small-cell lung cancer J Oncogene， 2009， 28( Suppl1) : S32-S37 6 王允芬 , 宋勇 . Afatinib( 阿法替尼 ) 治疗非小细胞肺癌的研究进展 J. 中华肺部疾病 , 2012, 5(4):364-370. 7 刘垒 , 冯杜 , 朱玉山 , 等 . 线粒体自噬的研究进展 J. 中国细胞生物学学报 , 2014, 30(10):959-966. 8 Mathew R， Kongara S， Beaudoin B， et a1 Autophagy suppresscs tumor progres
19、sion by limiting chromosomal instabilityJ j Genes Dev， 2007， 21(11)： 1367 81 9 Pan X, Zhang X, Sun H, etal. Autophagy Inhibition Promotes 5-Fluorouraci-Induced Apoptosis by Stimulating ROS Formation in Human Non- Small Cell Lung Cancer A549 CellsJ. Autophagy Inhibition Promotes Apoptosis, 2012, 8(3)
20、. 山东大学本科毕业设计论文 6 基质后成活的重要机制，对肿瘤转移有重要的促进作用 。（利用这一机制，在肿瘤发生转移的过程中加入自噬抑制剂，从而降低癌细胞的存活率。） 10 自噬对癌细胞的双重作用是其能否应用于抗癌药物研发的争议之处。 在肿瘤细胞中，自噬 的作用会与 肿瘤的类型、分期、性质以及机体损伤的程度有关。 11由此，在进一步了解其机制之前，不能盲目地自噬的诱导剂或抑制剂应用与临床。 1.4 化学遗传学 从自噬与癌症的关系可以看出细胞内部信号通路错综复杂，靶向治疗虽然前景很好，但在不了解其机制，就算效果再好也不能轻易将其应用于 临床。但随着交叉学科的发展，研究人员可以利用化学遗传学来研究
21、细胞内各种机制。 化学遗传学可以定义为一种利用小分子来研究生命系统各项生物学过程的工具。具有细胞通透性、特意选择性的小分子可以快速可逆地调控基因产物，条件依赖性地在细胞内或是有机环境中执行特定的功能。与传统上的遗传学相同，化学遗传学也可分为正向和反向两种。正向化学遗传即， 小分子化合物调节基因产物，在化合物作用下产生的异常表型会被筛选出来，从而鉴定出小分子的靶标蛋白。反向化学遗传学包括一个特定的蛋白（或是基因产物），通过与抑制其功能的配体相结合来筛选 ，一旦确定了特定蛋白相应的配体，把它导入细胞或是生物体系中便可以研究相应的表现型。相较传统的遗传学，它的优点包括： 高效：克服了繁琐的操作，产量
22、高，反应时间短，缩短了实验周期； 可控：因其往往具有浓度和时间依赖性，可根据需求，建立所需模型； 可清除：大部分小分子可通过细胞的新陈代谢或是外部调节清除； 特异性强：小分子往往只对应某一特定的蛋白，调节某一段特定的通路。 适用范围广：不仅可以应用于简单的生物系统，也可因应用于复杂生命系统。12 1.5 小分子的荧光特性 罗丹明类衍生物，能在一定条件下激发并发射荧 光，从而作为生物探针被广10 Jin S， DiPaola RS， Mathew R， et a1 Metabolic catastrophe as a means to cancer cell deathJ J Cell Sci，
23、2007， 120： 379 383 11 相建峰 , 林盛明 , 相燕洁 . 细胞自噬与肿瘤治疗 J. 中国中西医结合影像 , 2012, 10(2):174-176. 12 Cornelius J. O Connor, Spring L L A D R. Chemical geneticswJ. Chem Soc Rev, 2011(4):4332-4345. 山东大学本科毕业设计论文 7 泛应用。 13研究人员也可以利用这一特性观察小分子进入细胞之后，会进入于哪些细胞器，或是可以与哪些蛋白结合，以便初步地判断小分子是以何种机制调控细胞的生物学功能。 1.6 肺腺癌上皮细胞 A549 细胞
24、系 1972 年 ， Giard D.J.等人 通过 外植体培养从 58 岁的白种男性的肺腺癌组织中 获取了 A549 细胞系。 A549 细胞 既 能 表现出典型的肺腺癌细胞 ，有 具有型肺泡上皮细胞形态及特性 。因此这一细胞系可作为 模式细胞，广泛用于体外筛选抑制肺腺癌细胞 增殖和生长 的药物。 2007 年， 研究人员 公布了人类 肺腺癌基因组，发现了多个突变位 点 。这将有利于 肺腺癌的病理学研究从而为 抗癌药物 提供新的作用 靶点。 14 研究从化学遗传学的角度切入，通过一系列实验对合成的新型荧光小分子罗丹明类衍生物 ZXF 1-5-10 在 A549 细胞性的 生物学功能进行检测，
25、并对实验结果进行讨论。 2.材料和方法 2.1 材料 主要溶液及试剂配方 （见附录） 主要仪器设备（见附录） 实验材料 人肺腺癌 A549 细胞（军事医学科学院五所馈赠） 实验试剂及耗材 罗丹明 衍生物（山东大学化学院赵宝祥老师实验室） RPMI 1640 培养液 (美国 GIBCOBRL 公司 ) 新生小牛血清 （北京鼎国生物制品公司） 13 Lva H, Huangb S, Zhaoa B, etal. A new rhodamine B-based lysosomal pH fluorescent indicatorJ. Analytica Chimica Acta, 2013(788):177-182. 14 Foster KA et al, Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism, Exp Cell Res, 1998, 243(2): 359-366.
