1、 硕 士 学 位 论 文 筛选 VEGF 和 VEGFR高表达的肝癌细胞株及苦参碱的 初步干预作用 院（系）、所 药 学 院 研究生姓名 学科、专 业 药 理 学 导师姓 名 目 录 1 筛选 VEGF 和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株及苦参碱的初步干预作用 1 1.1 中文摘要 1 1.2 英文摘要 3 1.3 前言 6 1.4 1.5 1.6 材料与方法 8 结果 22 讨论 34 1.7 结论 39 1.8 参考文献 40 1.9 英汉缩略词对照 表 43 2 致谢 44 3 诱导肿瘤细胞凋亡的天然药物研究进展 (综述 ) 45 1 筛选 VEGF和 VEGFR高表达的肝癌细胞株及苦参
2、碱的初步干预作用 摘 要 目的： 原发性肝癌 (hepatocellular carcinoma， HCC)是血管富集性的肿瘤，其生长及转移和血管生成密切相关。血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor， VEGF)是体内一种强有力的促血管生成因子，通过与 VEGF 受体（ VEGFR）结合，引起一系列信号传导，释放各种生长因子和细胞因子，促进内皮细胞的增殖与迁移，直接或间接参与血管生成，在肝癌的发生、发展及愈后中具有极其重要的地位。本研究通过筛选 VEGF和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株，观察苦参碱等中药有效成分的初步干预作用，旨在构建靶向 V
3、EGF/VEGFR 信号通路抑制肝癌血管生成的细胞筛选体系，筛选靶向 VEGF/VEGFR 信号通路抑制肝癌血管生成的药物，为中药现代化及肝癌的药物治疗提供一个新的思路。 方法： （ 1）筛选 VEGF和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株：体外培养人肝癌细胞株 Bel-7402、 HepG2和 SMMC-7721，然后采用免疫细胞化学法检测该三种细胞的 VEGF 及其受体 Flt-1、 KDR 的表达情况，酶联免疫吸附试验法（ Enzyme-Linked Immunosorbent Assay， ELISA）检测细胞培养上清液中 VEGF 的浓度，逆转录聚合酶链式反应（ RT-PCR： Reve
4、rse Transcription Polymerase Chain Reaction）技术检测细胞中 VEGF mRNA 的表 达；（ 2）苦参碱等中药有效成分的初步干预作用：用小檗碱、槲皮素和苦参碱分别干预经过上述实验筛选出 VEGF 和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株 Bel-7402 48h，采用 CCK-8试剂盒 (cell counting kit-8)方法检测细胞的增殖，计算半抑制浓度（ IC50）。苦参碱干预 48h 后，采用 RT-PCR 方法检测 Bel-7402 VEGF mRNA 的表达。结果： （ 1）筛选 VEGF 和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株：免疫组化 可检
5、测HepG2和 Bel-7402细胞均具有 VEGF、 Flt-1和 KDR 的表达，而 SMMC-77212 细胞则只具有 VEGF 和 Flt-1 受体的表达，而无 KDR 受体的表达。 ELISA 检测 Bel-7402、 HepG2 及 SMMC-7721 细胞 VEGF 的表达量分别为811.4780.97、 744.9056.36 和 484.5470.69 ng/3105 个细胞， VEGF 表达Bel-7402 强于 HepG2 和 SMMC-7721 细胞 (F=24.317， P=0.000)。 RT-PCR检测 Bel-7402、 HepG2 及 SMMC-7721 细胞
6、均有 VEGF mRNA 表达，相对表达量分别为 0.9700.006、 0.9150.010、 0.7630.006， Bel-7402 的 VEGF mRNA 表达高于 HepG2 和 SMMC-7721 (F=636.167， P=0.000)。 据此，本研究选定 VEGF 和 VEGFR 均高表达的肝癌细胞株 Bel-7402 作为实验用细胞。（ 2）苦参碱等中药有效成分的初步干预作用：槲皮素、苦参碱和小檗碱对 Bel-7402 细胞均能起到抑制作用，且有随着药物浓度的增高抑制作用增强，通过 CurveExpert 1.3 软件计算，小檗碱、苦参碱和槲皮素的 IC50 分别为： 221
7、.12 g/mL、 1186.58 g/mL和 78.38 g/mL。 RT-PCR 方法检测结果表明，苦参碱作用于 Bel-7402 细胞 48h 后， VEGF mRNA 的表达量明显减少，且呈现较好的浓度依赖关系，与阴性对照比较， F=1229.64， P=0.000。结论： 通过免疫组化、 ELISA 及 RT-PCR 对人肝癌细胞株 HepG2、SMMC-7721 和 Bel-7402 的筛选， Bel-7402 中 VEGF 和 VEGFR 均高度表达，可作为靶向 VEGF/VEGFR 信号通路抑制肝癌血管生成的细胞筛选体系。苦参碱可明显抑制 Bel-7402 细胞的增殖，减少 V
8、EGF mRNA 的表达，初步提示苦参碱可能具有靶向 VEGF/VEGFR 信号通路抑制肝癌细胞增殖和血管生成的作用，但苦参碱是否还作用于 VEGF 的受体 Flt-1 和 KDR，尚需进一步研究证实。 关键词 ： VEGF； VEGFR；肝癌； RT-PCR；苦参碱 3 Screening Hepatocarcinoma Cell Line with High Expression of VEGF and VEGFR and the Preliminary Intervention of Matrine Abstract Objective: Hepatocellular carcinoma
9、 (HCC) is the enrichment of blood vessels of cancer, its growth and transfer are closely related with angiogenesis. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a powerful factor to promote angiogenic, through combination with VEGF receptor (VEGFR), cause a series of signal transmission, release gro
10、wth factors and cytokines, and promote endothelial cell proliferation and migration, directly or indirectly effect on angiogenesis, it plays an important role on occurrence and development of hepatocarcinoma. This study through screening hepatocarcinoma cell line with high expression of VEGF and VEG
11、FR, and observing preliminary intervention effect of matrine and some other effective ingredients of traditional Chinese medicine on the cell line, which is aimed at establishing the screening system targeted VEGF/VEGFR signaling pathways to inhibit angiogenesis of hepatocarcinoma, which is used to
12、screen the drugs targeted VEGF /VEGFR signaling pathways to inhibit angiogenesis of hepatocarcinoma, and providing a new train of thought for the modernization of traditional Chinese medicine and drug treatments for hepatocarcinoma. Methods: (1) Screening hepatocarcinoma cell line with high expressi
13、on of VEGF and VEGFR: Culture human hepatocarcinoma cell lines Bel-7402, HepG2 and SMMC-7721 in vitro, then the expression of VEGF and its receptor Flt-1, KDR were detected by Immunohistochemistry detection. Using the ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) method to detect the expression of
14、 VEGF in the cell supernatant, and taking the method of Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR) technology to detect the expression of VEGF mRNA; (2) The preliminary intervention effect of matrine and other traditional Chinese medicine: Berberine, quercetin and matrine, the tradition
15、al Chinese medicine, intervened Bel-7402 cell line 48 hours, which existed high expression of VEGF 4 and VEGFR screened form above experiment. The proliferation of Bel-7402 cell was detected by CCK-8 kit (cell counting kit-8) method, then calculating the half inhibition concentration (IC50). After 4
16、8 hours intervened with matrine, the expression of Bel-7402 VEGF mRNA was tested by RT-PCR. Results:(1) Screening hepatocarcinoma cell line with high expression of VEGF and VEGFR: Immunohistochemical detection showed that the HepG2 and Bel-7402 cells had VEGF, Flt-1 and KDR expression, but SMMC-7721
17、 cells only had VEGF and Flt-1 expression, with no KDR expression. ELISA test suggested that the expression of VEGF in the cell supernatant from Bel-7402, HepG2 and SMMC-7721 were 811.4780.97, 744.9056.36 and 484.5470.69 ng/3105cells, respectively. Expression of VEGF in Bel-7402 cell exceeded HepG2
18、and SMMC-7721 cell(F=24.317, P=0.000). RT-PCR detection showed that Bel-7402、 HepG2 and SMMC-7721 cell existed expression of VEGF mRNA, relative expression volume were 0.9700.006, 0.9150.010 and 0.7630.006， respectively. Expression of VEGF mRNA in Bel-7402 cell was beyond HepG2 and SMMC-7721 cell (F
19、=636.167, P=0.000).Therefore, this study selected Bel-7402 with high expression of VEGF and VEGFR as experimental use cells. (2) The preliminary intervention effect of matrine and other traditional Chinese medicine: Quercetin, matrine and berberine could significantly inhibit proliferation of Bel-74
20、02 cells, It showed a favorable dose-effect relationship because Inhibitory activity strengthened with the increase of concentration. Calculating by the CurveExpert 1.3 software, IC50 of berberine, matrine and quercetin were 221.12 g/mL, 1186.58 g/mL and 78.38 g/mL,respectively. RT-PCR testing resul
21、ts showed that 48 hours after Bel-7402 intervened by matrine, the expression of VEGF mRNA significantly decreased in a good concentration dependence relationship. Compared with control, F=1229.64, P=0.000. Conclusion: screening from human hepatocarcinoma cell line Bel-7402, HepG2 and SMMC-7721 cell
22、by immunohistochemical, ELISA and RT-PCR, Bel-7402 cell existed highly 5 expression of VEGF and VEGFR, which can be used to cells screening system targeted VEGF/VEGFR signaling pathways to inhibit angiogenesis of hepatocarcinoma. Matrine can inhibited Bel-7402 cell proliferation, significantly decre
23、ased VEGF mRNA expressions, it was suggested that matrine may have targeted VEGF/VEGFR signaling pathways to inhibit proliferation and angiogenesis of hepatocarcinoma. However, Matrine wether or not has effect on Flt-1 and KDR, the receptor of VEGF, which needs to be further research. Key Words: VEG
24、F； VEGFR； Hepatocarcinoma； RT-PCR； Matrine6 前 言 自 1971 年 Folkman 首次建立了血管生成与肿 瘤生长之间的联系以来，人们认识到恶性肿瘤的增殖、浸润和转移与肿瘤诱导的血管生成(angiogenesis)密切相关 1。新生血管为肿瘤细胞提供充分的氧气和营养，原发瘤和转移瘤生长到 0.20.3 cm 时，如果没有新生血管供应营养，肿瘤将停止生长并死亡。因此，以肿瘤血管内皮细胞为靶点抑制肿瘤血管生成阻断肿瘤血液供应已成为当前抗肿瘤生长和转移的研究热点之一。 原发性肝癌是我国和一些亚非地区常见癌症，是我国最常见的恶性肿瘤之一。原发性肝癌 90%
25、以上为肝细胞肝癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)，它是血管富集性的肿瘤，其生长及转移和血管生成密切相关。 HCC合并失代偿性肝硬化、易发生肝内血管侵犯导致肝内播散和切除后复发或再发率高是影响现有各种治疗手段对肝癌疗效的主要因素。现有的各种临床治疗手段都不足以从根本上解决上述三个问题，肝癌治疗方面的突破有赖于对肝癌生物学特性的进一步研究。肝癌具有多血管、恶性程度高、生长速度快、转移范围广和复发率高等特点 2。建立在对肝癌细胞生物学特性不断阐明基础之上的抗血管生成治疗有可能在肝癌的治疗上取得突破进展。 血管生成是肿瘤得以继续生长的基础，它是一个多步骤 的复杂过程，需要
26、大量促进血管生成因子和抑制血管生成因子参与调控，其中血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor ,VEGF)是起核心作用的血管形成正调节因子。 VEGF 是一种高度糖基化的碱性蛋白，具有促进内皮细胞增殖，增加微血管通透性、诱导血管生成等功能的生物学效应 ,由VEGFR-1(Flt-1)及 VEGFR-2(KDR)介导，其大部分表达于血管内皮 3。肿瘤组织中的 VEGF 通常在缺氧、致癌基因、和其他细胞因子的刺激下过度表达，而且在多种肿瘤中与愈后不良密切相关。 许多研究表明 VEGF 在许7 多肿瘤组织中均有较高水平的表达，它不但促进肿瘤的血管生成，
27、也促进了肿瘤的侵袭和转移，与多种肿瘤的发生发展、转移和愈后密切相关。研究发现， VEGF 可维持肿瘤过度生长的血供需求，可通过上调血管内皮VEGFR 水平使血管生成正反馈加强；许多肿瘤可同时表达 VEGFR 使VEGF 作为旁分泌因子促进自身恶性增殖； VEGF 介导的树突细胞分化抑制还可减少其免疫监视性滤过作用。此外， VEGF 使血管通透性增高，致肿瘤区组织间压升高，以及血管异常增生迂曲形成盲端，均使化疗药物不易送达肿瘤内部发挥效应，肿瘤细胞 却易于进入血循环向远处转移播散。因此 VEGF 在肝癌发生、发展过程中占有十分重要的地位 4,5。 VEGF/VEGFR 信号转导通路在肿瘤周围血管
28、生成起主要作用，目前上市的抗血管生成药物大多数都是以 VEGF/VEGFR 信号转导通路中的关键分子作为药靶而设计的，例如贝伐单抗 6、兰尼单抗、索拉非尼和舒尼替尼等。近年来，随着对肿瘤血管生成机制研究的不断深入，抗血管生成药物也得以快速研发，其中对天然药物及其组分的研究占有相当大的比例，中药由此成为研究的重点和热点。研究发现小檗碱 7可抑制 HUVEC 的增殖，诱导 其凋亡，阻止新生血管形成。槲皮素 (Ouercetin)8能够显著地抑制肿瘤生长，并且可呈剂量依赖性地抑制 VEGF 和 bFGF 诱导的鸡胚尿囊膜（ chick chorioallantoic membrane， CAM）血管
29、增生。苦参碱可不同程度地抑制肿瘤血管生成，降低肿瘤组织微血管密度 (microvessel density, MVD)，其作用机制在于抑制瘤体内 VEGF 和 bFGF 的表达。 本研究通过筛选 VEGF 和 VEGFR 高表达的肝癌细胞株，观察苦参碱等中药有效成分的初步干预作用，旨在构建靶向 VEGF/VEGFR 信号通路抑制肝癌血管生成的细胞筛选体系，为中药现代化及肝癌的药物治疗提供一个新的思路。 8 材料与方法 1 实验材料与仪器 1.1 主要实验材料： 1.1.1 细胞株：人肝癌细胞株 HepG2、 SMMC-7721 和 Bel-7402 及人脐静脉细胞 ECV304，购自中科院上海
30、药物研究所，用含 10%胎牛血清的RPMI1640 培养液于 5%CO2、 37 的培养箱内培养，每 23 天更换培养液，待细胞单层生长铺满瓶底约 80%时，用 0.25%的胰酶消化传代。 1.1.2 实验药品： （ 1） 98%槲皮素：陕西浩洋公司， 生产批号： 20100102 （ 2） 98%苦参碱：陕西浩洋公司，生产批号： 20100201 （ 3） 97%小檗碱：陕西浩洋公司，生产批号： 20100214 （ 4） 顺铂注射液： 10 mg/mL,盏花药业有限公司，生产批号： 20090605 1.2 主要实验试剂 1.2.1 细胞培养主要试剂 （ 1） RPMI1640 培养基： GIBCO 公司 （ 2） 胰蛋白酶：美国 Sigma 公司 （ 3） 胎牛血清：天津灏洋生物制品科技有限公司 （ 4） 酒精：重庆北碚化学试剂厂 （ 6） 二甲基亚砜： Sigma 公司 1.2.2 免疫组织化学染色与 ELISA 试剂 （ 1） Human VEGF ELISA 试剂盒：武汉华美生物工程有限公司 （ 2） PV 法兔二抗试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司 （ 3） 兔抗人 VEGF 多克隆抗体：武汉博士德生物工程公司 （ 4） KDR 一抗：武汉博士德生物工程公司 （ 5） Flt-1 一抗：武汉博士德生物工程公司
