1、实时荧光定量PCR技术与应用,胡亮 15171469708,提纲,PCR概念,什么是PCR？Polymerase Chain Reaction (PCR)聚合酶链反应是在体外选择性的扩增特定DNA片段的方法。,Classic PCR,Classic PCR,PCR 循环,第一步 加热变性、双链打开,第二步退火、引物与单链结合,第三步 - 引物延伸,变为两个双链DNA,常规PCR,常规PCR技术：PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析,提纲,定量PCR,定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析
2、,Qtower2.2,PCR反应混合物,提纲,SYBR Green 1,TaqMan,荧光化学,SYBR Green I,SYBR Green 1,SYBR Green I 工作原理,SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 1染料结合状态时荧光强度是非结合状态的800-1000倍,SYBR Green I,SYBR Green I,SYBR Green I,与传统PCR的比较,实现了初始模板的绝对定量检测灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因可以区分微小的拷贝数差异可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量省时省力检测设计灵活,Melt Curve Analysi
3、s,Melt Curve Analysis,SYBR Green I 优点,使用方便 - 不必设计复杂的荧光探针 没有序列特异性 - 可以用于不同的模板 便宜 灵敏,SYBR Green I 缺点,与非特异性产物结合,TaqMan,探针,荧光素,淬灭剂,TaqMan,水解型杂交探针,TaqMan,目标特异性探针 5为荧光素， 3为淬灭剂,与目标序列互补,TAQMAN Probes,TAQMAN Probes,TAQMAN Probes,TAQMAN Probes,TaqMan优点,对目标序列有很高的特异性 -特别适合于SNP检测,TaqMan缺点,价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解
4、曲线分析 背景高,兼容化学试剂总结,荧光曲线,随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图,定量原理,如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念： 荧光阈值、Ct值,定量原理,荧光阈值,在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准),阈值线,定量原理,Ct值的概念,Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数,阈值线,提纲,绝对定量 确定初始模板的准确含量 需要标准曲线 相对定量 确定样品间初始模板的含量倍数差异 相
5、对标准曲线 不使用标准曲线，利用Ct值计算 Ct方法 Ct方法（看家基因） Pfaffl方法（考虑扩增效率） Vandesompele方法（多看家基因）,定量方法,借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量得到未知样品初始量绝对值,Unknown contains 3108 copies,绝对定量,CT 法相对定量 无均一化处理 均一化依赖于加样的一致性,相对定量CT,Sample1 Ct1 (25) Sample2 Ct2 (22)CT=Ct1-Ct2 =25-22=3基因表达量Sample1/Sample2=2 CT= 2-3=1/8,相对定量CT,CT法相对定量 考虑到了加样误差
6、通常使用看家基因来完成均一化处理,Sample1 Ct1(25) Sample2 Ct2(22)内参基因 actin Ct 01 20 Ct02 21CT1= Ct1-Ct01=25-20=5 CT2=Ct2-Ct02=22-21=1CT= CT1- CT2=5-1=4基因表达量Sample1/sample2=2- CT=2-4=1/16,Simple,Complex,2CT 假定目的基因与看家基因的 扩增效率都是100% 只有一个看家基因 Pfaffl Modification 考虑到扩增效率的影响 只有一个看家基因 Vandesompele Method 考虑到扩增效率的影响 有多个看家基
7、因,相对定量,利用相对标准曲线定量，定量结果相除得到倍数差别 同时建立两条标准曲线 一条目的基因的标准曲线 至少再做一条看家基因的标准曲线 借助标准曲线校准扩增效率的影响,使用标准曲线法进行相对定量分析,相对定量标准曲线法,进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计 用于优化扩增产物产量和特异性的参数 引物设计 扩增片段选择 试剂的浓度 循环条件 变性温度和退火温度,PCR体系优化,利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化,退火温度的优化,溶解曲线,扩增曲线,1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC f
8、or 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec6. Plate Read7. Go to line 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, hold 1 sec.,退火温度的优化,实时荧光定量PCR应用,定量： DNA定量 RNA定量定性： SNP分析 基因型分析 RNA变异分析 融解曲线分析,定量PCR应用I-实时定量,定量PCR应用II：终点读板, 基因突变分析单基因遗传病诊断，如血友病、地贫 SNP扫描疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP的鉴定SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异药物副反应的预防，如麻醉意外 物种鉴定、菌株鉴定各种病毒，细菌，病毒病原体检测，如炭疽菌，E coli. O157,感谢各位光临！,
