1、 本科 毕业设计 （ 20 届） 磁性微球固定 DNA 的电化学生物传感器的研究 所在学院 专业班级 化学工程与工艺 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 本文提出了一种基于超支化聚合物放大标记的常规示差脉冲检测方法。首先将超支聚合物通过化学键固化在纳米磁性微球表面， 经过 EDC/NHS 活化，与探针 DNA 结合，在特定的条件下与待检测的 DNA 单链相结合，形成双链 DNA，加入耐尔兰作为杂交指示剂，使其镶嵌到 DNA螺旋结构的间隙里，采用常规示差脉冲伏安法（ DPV)进行测定。 检测线性范围为 1.010-6mol/L 1.010-10mol/L，检出限为 4
2、.210-11moI/L。 实验结果表明本法响应迅速，特异性好，灵敏度高，检测简单方便。 关键词 : 纳米磁性微球， DNA检测，耐尔兰，超支化聚合物 II Abstract: In this paper,presents a mark of hyperbranched polymers based on the conventional method of differential pulse detection。 First, hyperbranched polymers cured by chemical bonds at the surface of nano-magnetic bea
3、ds,After EDC / NHS activation,Then with the corresponding target cells reaction,in certain conditions to be detected with the combination of single-stranded DNA,formation of double-stranded DNA,into NILE BLUE embedded into the DNA helix structure to the gap,used DPV to detection. The linear response
4、 of the sensor to hydrogen peroxide was in the concentration range of 1.010-6 mol/L 1.010-10 mol/L, with a detection limit of 4.210-11moI/L.Experimental results showed that enlarged the electric sign and exhibited fast response, high sensitivity and good stability， detection of simple and convenient
5、. Keywords: Nano-magnetic beads; DNA detection; NILE BLUE; Hyperbranched polymers III 目 录 摘要 .I Abstract . II 1 绪论 . 1 1.1 选题背景 . 2 1.2 相关研究成果 . 3 2 实验部分 . 5 2.1 实验内容 . 5 2.2.1 实验仪器 . 5 2.2.2 实验试剂 . 5 2.2 方法分析 .6 2.2.1 指示剂的配制 . 7 2.2.2 酰胺磁性微球的清洗 . 7 2.2.3 超支化聚合物的清洗 . 7 2.2.4 酰胺磁性微球和超支化聚合物的活化 .7 2.2.
6、5 实验步骤 .8 2.2.6 电化学检测 .8 3 结果与分析 . 9 3.1 纳米电化学 DNA 传感器嵌合耐尔兰后的电化学行为 . 9 3.2 超支化聚合物的表征 . 10 3.3 水浴杂交时间优化 . 错误 !未定义书签。 3.4 杂交温度的选择 . 错误 !未定义书签。 3.5 线性关系 .检测限和变异系数 . 错误 !未定义书签。 3.5.1 线性关系 . 错误 !未定义书签。 3.5.2 检出限 . 错误 !未定义书签。 3.5.3 变异系数 .14 4 结论 . 15 参考文献 . 16 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 选题背景 磁性高分子微球 1作为药
7、物载体，被注射到动物体内，在外 加磁场下，通过纳米粒子的导航，移向病变区，这就是磁性纳米粒子在药物中应用的基本原理用磁性高分子微球作为药物载体可以提高药效，降低药物对正常细胞的伤害，成为磁控导弹，这也是当今的热门课题之一 纳米磁性微球是一种以纳米磁粒为核心外面包裹一层高分子膜的一类新型材料。 纳米 磁性微球 粒径小，比表面积大，具有较好的分散性、胶体稳定性和生物相容性，一方面它可通过聚合、表面改性等途径，赋予其表面多种反应性官能团 (如羟基、羧基、氨基、醛基等 )，还可通过吸附或共价键合的方式与酶、细胞、药物等生物活性物质结合；另一方面，它具有 超顺磁性，可以很方便地在外加磁场作用下进行导向或
8、分离。并且纳米 磁性微球经过生物修饰，可以使样品中的痕量组分最大限度地富集起来。利用磁响应性进行分离，实现分离与富集同步进行，其分离效率远优越于常规分析方法，而且操作简便，不需要昂贵的仪器。 目前，纳米磁性微球被广泛应用于生物技术、催化、分离和医学等领域，如免疫分析、酶的固定化、 DNA靶向药物、蛋白质纯化、细胞分离 5。 超支化聚合物是一类具有三维立体构造高度支化的聚合物，单分子尺寸也是在纳米级，分子之间无缠绕，具有高溶解性 、低粘度 、强的 化学反应活性 及大量末端官 能团。它的制备简单，纯化步骤少，成本较低，其端 基 可进一步功能化。目前 在 涂料、纳米 材料、 聚电解质、生物传感器等多
9、个领域有着广泛的应用前景 。 从生物样品中提取核酸是分子生物学和临床医学等生命科学研究领域中的一项基本技术。核酸提取的传统方法如酚 -氯仿抽提法 2，存在着有机溶剂毒性大、重复性劳动多、难以实现微型化、自动化操作等缺点。而近年来发展起来的以玻璃粉 3、离子交换树脂 4,5、硅胶 6等为吸附材料的核酸固相萃取法，不仅可以避免使用毒性强的有机溶剂，而且能大幅度提高提取效率。基于固相萃取技术的核 酸纯化微芯片已经引起了人们的广泛关注。磁性微粒作为一种新型的核酸固相萃取剂，借助于适当的磁分离装置，可以进一步简化和加速核酸的分离与纯化过程，实现核酸纯化 7,8处理的微型化、自动化和平行化。 超支化聚合物
10、是一类具有近似球形结构 ,富含端基 ,高溶解性、低粘度、高活性的聚合物 ,在涂料工业、流变学改性剂、超分子化学、纳米科技、膜材料、生物医用材料、光学及电学材料等多个领域有着广泛的应用前景 。 超支化聚合物的性能受其端基性质的影响很大 ,每个端基都可以进一步功能化 ,制得功能性超支化聚合物 。 通过调节功能化位置和 数目能够改善超支化聚合物的功能2 性 ,实现超支化聚合物在不同领域的应用 ,因此 ,对其功能化反应的研究具有重要的理论和实际意义 。 随着人类对疾病基因根源不断深入了解 ,对 DNA碱基突变快速、便捷、准确的检测方法的研究正越来越受到人们的重视。现代医学的研究表明：人类的许多遗传疾病
11、均与 DNA碱基序列不同程度的变异有关，因此它在基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗等方面也具有十分重要的意义，特定 DNA序列的检测已逐渐成为生命科学的一个重要课题。对 DNA常见的分析方法有色谱法、分光光度法、荧光光度法、光散射技术及电化学 法等，其中电化学方法是一个重要领域，有关报道较多。 DNA的研究通常包括：对生物样品中 DNA的含量进行测定，确定 DNA结构和碱基对序列，研究环境中污染物质对 DNA损伤机理，对 PCR产物进行检测，以及研究各种小分子和金属配合物与 DNA相互作用等等方面。因此对特定序列 DNA的分析以及对 DNA链中碱基突变的拎测在基闻筛选、法医学攀定、遗传疾病的早
12、期诊断和治疗、病原基因的测定方面具有十分深远的意义。 DNA生物传感器技术作为一种行之有效的方法是一门集多种学科为一体的综合性技术 ,如 :生物、化学、医学、物理、电子技术等。近 些年来 ,各种不同类型的 DNA生物传感器也被争相报道。其中 DNA电化学生物传感器因其测试方法简单、可靠、检测选择性好、灵敏度高、成本低等显著特点而倍受人们青睐。电化学 DNA生物传感器以电信号为检测基础 ,与 DNA生物芯片技术相兼容 ,使其在未来商业应用上具有深远意义 9。 1.2 相关研究成果 具有电活性的杂交指示剂与单链 DNA和双链 DNA以不同的结合能力或结合方式相互作用 ,它对双链 DNA比对单链 D
13、NA有更高的特异性结合能力 ， 可用来有效地区分单链 DNA和双链 DNA。一般地说 ， 双链 DNA与指示剂的相互作用为静电 作用和内部疏水作用 ,而单链 DNA主要是静电作用10 。 DNA电化学生物传感器的工作原理将 ssD NA作为敏感元件固定在固体电极表面，加入具有电活性的物质作为杂交指示剂，通过检测修饰电极在待测溶液中电化学信号的变化来测定 DNA的量。 1.检测痕量 Hg2+的 DNA电化学生物传感器 11 测定痕量汞的方法主要有等离子体电感耦合质谱法 (ICP-MS)、阳极溶出伏安法、荧光探针法等 . 这些方法或者需要昂贵的仪器 , 较长的分析周期 , 或者需要复杂的样品预处理
14、步骤 . 和传统的检测方法相比 , 基于电极表面分子构象变化 的电化学生物传感器具有简单、灵敏、快速、廉价等3 诸多优点 ， 新型电化学生物传感器的研究也日益受到重视 。 本文利用自组装方法构建了检测 Hg2+的 DNA电化学生物传感器 ， 通过电极表面 DNA 分子和 Hg2+作用造成的构象变化 ， 检测溶液中的Hg2+浓度 。 首先 ， 在金电极表面组装修饰有二茂铁基团的富 T序列 DNA 探针 ， 汞与探针分子的 T 碱基可形成发卡结构 ， 从而使 DNA构象发生改变 ， 通过 DNA末端二茂铁基团氧化还原电流的变化 ,实现了对痕量 Hg2+的快速检测 。 2.离子液体与纳米材料协同电催
15、化的新型电化学生物传感器 12 离子液体 具有良好的离子导电性、较高的热稳定性和化学稳定性、宽的电位窗口和液态温度范围等特点，已被广泛应用于电化学生物传感器的研究。纳米材料由于其量子尺寸效应和表面效应，可以有效地提高化学或生物传感器的性能。该文主要就近年来基于纳米材料和离子液体复合材料修饰的电化学生物传感器方面进行介绍并对该领域的发展作一展望。离子液体由于其优异的性质在碳纳米管技术中的应用逐渐引起了人们的关注。离子液体作为一种分散剂能够分散碳纳米管且不会发生团聚，因此，其在碳纳米管的共价功能化、非共价功能化及制备聚合物复合材料中都有广泛的应用。经过 离子液体修饰的碳纳米管可以提高其稳定性和兼容
16、性，并能提高电化学反应的接触面积，为碳纳米管在传感器中的应用创造了更多的机会。 3. 基于树状高分子固定 DNA的电化学生物传感器 13 电化学氧化法使玻碳电极表面氧化生成羧基，利用偶联活化试剂将 1.0G树状高分子 (PAMAM)固定在玻碳电极表面，并通过共价结合固定 ssDNA。以亚甲基蓝为指示剂，采用循环伏安法、示差脉冲伏安法等电化学方法对 DNA电化学生物传感器进行了表征。结果发现，通过亚甲基蓝与双链 dsDNA作用的氧化还原电流的变化，可以识别和定量检测溶液中互补的 ssDNA片段。经过条件优化，本法测定 DNA的浓度线性范围为 210-9-210-7mol L，检出限为 110-9
17、mo L.此方法既增加了 DNA传感器的稳定性，又增加了修饰层上 DNA探针的固定量，提高了传感器检测的灵敏度。 4. 基于适体和生物条形码放大技术多组分电化学生物传感 14 适体 (Aptamer)也称为核酸适体、适配体、适配子等，是一段由 25 80个碱基组成的单链寡核苷酸片段，可以是 DNA也可以是 RNA0,21。它是通过指数富集配体系统进化 (SELEX)技术从人工构建的随机单链寡核苷酸文库里筛选 出来，可以结合蛋白质、氨基酸、药物或无机离子等目标分子。适体作为传感器的分子识别物质与其它分子识别物质相比，具有高特异性、高亲和力、目标分子范围广、稳定性好等优点，广泛用于生物传感器的研究
18、。在作为传感面的金电极上固定两种巯基修饰的探针 DNA，它们分别与含有腺苷适体和凝血酶适体的 Linker DNA的一部分互补。然后探针 DNA与各自对应的 Linker DNA杂交，该 Linker DNA已经与金纳米粒子表面的报告 DNA进行了4 预杂交。金纳米粒子表面固定了两种不同的 DNA，一种与 Linker DNA互补，另外一种不 互补，只是起到连接不同的金属硫化物纳米粒子的作用。当有腺苷和凝血酶分子存在的时候，适体部分发生弯曲包裹住各自的目标分子形成复杂结构 ， 同时，连接有金属硫化物纳米粒子的金纳米粒子就会从电极表面脱落，进入到溶液中。对溶液中的金属硫化物纳米粒子采用 ASV进
19、行测定，腺苷和凝血酶分子的浓度与各自对应的金属硫化物的溶出信号成正比。 5. 脱氢酶电化学生物传感器 15 自然界中超过 400种脱氢酶使用辅酶 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP+)作为生物催化反应中氢和电子的传递体，因此烟酰胺型辅 酶的电化学氧化对构筑此类脱氢酶电化学生物传感器具有重要的意义。辅酶的电化学氧化可应用到脱氢酶电化学生物传感器的设计之中。由于 NAD(P)+ NAD(P)H氧化还原对的标准氧化还原电位 E0值较低，所以 NAD(P)+ NAD(P)H的电化学再生与相关的脱氢酶结合，可用于构筑多种电化学生物传感器，其基本工作原理如图 3所示。
20、其中，还原型辅酶 NAD(P)H在电子媒介体帮助下的电化学氧化是构筑此类传感器的关键技术之一。如果能实现对反应体系中产生的 NAD(P)H的快速检测，再与相应的脱氢酶相结合，可实现对生化底物的有效分 析。在辅酶电化学氧化研究的基础上，一些生物传感系统已经通过 NAD(P)H电化学监测系统与相应的脱氢酶相结合而发展起来。这些脱氢酶包括： GIDH、 FDH、FALDH、 ADH、 LDH等。在传感器的构筑中使用了多种不同类型的电极材料，例如金电极、碳电极 (包括碳糊电极、玻碳电极和石墨电极，但以碳糊电极居多 )等。 本文提出了一种基于超支化聚合物标记的常规示差脉冲检测方法。首先将超支聚合物通过化
21、学键固化在纳米磁性微球表面，经过 EDC/NHS活化，然后与相应的探针 DNA结合，在特定的条件下与待检测的单链 DNA杂交，形成 DNA双链，加入耐尔兰进行标记，使其镶嵌到 DNA螺旋结构的间隙 里 ，采用常规示差脉冲伏安法（ DPV)进行测定。本法响应迅速，特异性好，灵敏度高，检测简单方便。 5 2 实验部分 2.1 实验内容 2.1.1 实验仪器 表 2-1 实验主要仪器 仪器名称 规格 生产厂家 电化学工作站 CHI660A 上海辰华仪器公司 工作电极 Teflon反应池 参比电极 饱和 Kcl电极 上海 CHI公司 辅助电极 Pt丝电极 上海 CHI公司 超声仪 SY1200 上海声
22、源超声波仪器设备有限公司 制超纯水仪 Newhumanup900 Human cooperation. Ltd 电子天平 AL204 梅特勒 -托利多仪器有限公司 高速冷冻离心机 H-1600RW 江东仪器 漩涡混合器 MS-3 超级恒温槽 CH1515 上海精密科学仪器有限公司 2.1.2 实验试剂 表 2-2 实验主要试剂 试剂名称 规格 生产厂家 探针 DNA 3.3210-6mol/L 浙江大学生物研究所 靶 DNA 4.2410-6mol/L 浙江大学生物研究所 耐尔兰 分析 纯 浙江省临安兰岭化工有限公司 EDC 分析纯 上海化学试剂有限公司 NHS 分析纯 浙江海正药业股份有限公
23、司 6 磷酸一氢钠 分析纯 湖州湖试化学试剂有限公司 磷酸二氢钠 分析纯 湖州湖试化学试剂有限公司 溶液配制： 1、磷酸盐缓冲液（ pH 7.4）； 2、耐尔兰溶液 (1.010-3mol/L); 3、 EDC(0.1mol/L)； 4、 NHS(0.1mol/L)； 5、 探针 DNA（ 3.3210-7mol/L， 3.3210-8mol/L）； 6、 靶 DNA（ 2.1210-7mol/L， 2.1210-8mol/L） . 实验所用试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水 。 2.2 分析方法 本文是采用常规示差脉冲伏安法 （ DPV)进行测定 DNA的 电化学行为，并研究影响修饰电极伏安行为的因素，建立一种新型的分析方法，并将此法用于 DNA传感器的测定。 本文利用了超支化聚合物放大检测信号和自制 Teflon反应池工作电极，使实验更加简单方便，灵敏度也有所增加。 +C O O HC O O HH O O CN H 2N H 2T P P / P yN M PC O O HC O O HC O O HH O O CC O O HC O O HH O O CH O O CH O O CC O O HH O O CH O O CH O O C图 2-1 超支化聚合物制备示意图
