1、 本科毕业论文 （ 20 届） 一株淡水螺旋藻的培养条件优化 所在学院 专业班级 海洋科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 中文 摘要 .错误 !未定义书签。 英文摘要 .错误 !未定义书签。 引言 . 1 1 材料与方法 . 3 1.1 实验材料 . 3 1.2 实验方法 . 5 1.2.1 实验前期准备 . 5 1.2.2 不同 pH 下对螺旋藻吸光度的 测量 . 5 1.2.3 不同温度下对螺旋藻吸光度的测量 . 5 1.2.4 不同光照时间下对螺旋藻吸光度的测量 . 5 2 实验结果与分析 . 6 2.1 pH 对螺旋藻生长的影响 . 6 2.2 温度对螺旋藻生
2、长的影响 . 8 2.3 光照对螺旋藻生长的影响 . 10 讨论 . 12 3.1 明确实验目的 . 12 3.2 研究展望 . 12 小 结 . 13 参考文献 . 14 附译文 .错误 !未定义书签。 致谢 .错误 !未定义书签。 I 摘要 由于全球性的 蛋白质短缺 ,急需开辟新的蛋白源。蛋白含量高达 50%-60%的螺旋藻是很有开发价值的蛋白质新资源。目前螺旋藻具有非常广阔的市场，其保健功效得到了广泛的认可。螺旋藻的养殖方式、养殖效率是很多研究者关注的问题。螺旋藻应用于生产，首先要提供适宜的生长条件，这是实验得以进行的基本前提。影响螺旋藻生长的因素有光照、温度、 pH、藻密度、氨氮负荷、
3、 COD 负荷等。实验中采取单因子法，首先考察其中一个因子，设计变化梯度，固定其他因子，定时观察各梯度水平下螺旋藻的生长情况并测定其对模拟废水中氨氮去除的情况。如此逐一考察所有因子， 并结合应用条件的可行性，最终得到最佳适宜的条件。 本课题研究研究在不同条件下螺旋藻的生长状况，设置一系列 pH、温度、光照条件梯度，通过分光光度法测定藻密度。通过分析实验所得的数据，研究在不同条件下螺旋藻生长的规律，并为最终实现高效养殖螺旋藻提供有价值的参考。结果表明，螺旋藻的最佳条件适宜生长环境条件为 pH 在 6-10 之间，温度处于 25-40之间。在 3klx 光照强度下，光照时间为 12-20小时生长最
4、佳。 关键词 螺旋藻； pH ；温度 ；光照；生长规律 II Abstract Due to global protein shortages， we need open up new protein source. Spirulina which Protein content reaches as high as 50% - 60% is a new resource development value the protein. At present the spirulina has very broad market, its health care efficacy gained w
5、idespread acceptance. The breeding methods, breeding efficiency of spirulina is many researchers concern. If spirulina applied to production, first to provide appropriate growth conditions, this is the basic premise of experiment to be carried out. The Influence of spirulina growth has light, temper
6、ature, pH, algal density, ammonia nitrogen load, COD load, and so on. Adopt single factor experiment, the first investigation method of one factor, design change gradient, fixed other factors, timing observation of the gradient level growth situation of spirulina and determine it for simulation of r
7、emoving ammonia nitrogen in waste water. So investigate all of the factors, and the feasibility of application conditions, and finally gain the best suitable conditions. This research studies in different conditions of spirulina growth, and set up a series of pH, temperature, lighting conditions gra
8、dient, by trophotometry algae density. Through the analysis of the experimental data, research in different conditions, and the regularities of the spirulina growth for finally realize efficient breeding spirulina provide valuable reference. The results showed that the best suitable for spirulina gr
9、owth environment conditions is PH in 6 10, temperature in 25 40 . In 3klx light intensity, light time for 12 to 20 hours. Key words Spirulina; PH; temperature; Illumination time; growth rhythm 1 引言 螺旋藻是一种单细胞组成的不分支、无异形胞的螺旋状卷曲丝状体，藻丝两端略细，末端细胞钝圆或顶端细胞外壁增厚或具帽状结构。细胞呈圆柱、短圆柱或方形，细胞大小、藻丝宽度因种而异，形状易受环境影响，有时甚至产生稳
10、定的直线形变异 1。进行二分裂无性繁殖，依靠简 单的细胞分裂增加藻丝长度，细胞分裂面与藻丝的纵轴垂直的单细胞微藻类蓝绿色光合白养植物 ,属蓝藻门。其广泛分布在热带、亚热带和暖温带的海洋、湖泊、温泉，特别是盐碱湖中 2。 最初发现螺旋藻是在 1940年，法国药物学家 Creach 到非洲乍得湖探险时发现的。直到 20世纪 60 年代，由于世界粮食和能源危机日益突出的情况下，螺旋藻的一些报道才引起藻类学者、营养学家、企业家、政府官员的高度重视 2。螺旋藻营养丰富，富含蛋白质、维生素、矿物质及多种生物活性物质，纤维素含量少，脂肪和胆固醇含量极低，且其细胞壁由粗蛋白组成， 细胞膜很薄，极易被人体消化吸
11、收，科学家们发现 1g的螺旋藻所含的营养相当于 1000g 各种蔬菜的营养总和 3近几十年来，美国、日本和德国等国家对螺旋藻进行了大量医疗保健功能的试验。研究证实，螺旋藻具有抗疲劳、耐缺氧、免疫调节、调节血脂、抑制肿瘤五大主要功能，有着极其重要的营养、药理及开发利用价值 4,5。此外，综合各国学者的研究结果来看，螺旋藻及其抽提物对肝病、慢性胰腺炎、糖尿病、青光眼、白内障、恶性贫血、胃溃疡及肥胖症等都有良性效果。随着研究的深人，螺旋藻应用领域逐渐扩展，从最初的营养型食品扩大到食品添加 剂、医疗保健、化妆品和精细化工等，产品已达几十种之多。联合国粮农组织郑重向全世界推荐，螺旋藻是 21 世纪最优秀
12、的营养食品由于螺旋藻被公认为人类最优秀的营养保健食品 6。 我国的微藻研究起于 20 世纪 50 年代，目前已应用于工业化生产的微藻主要是螺旋藻，小球藻，盐藻和血球藻等，其中螺旋藻的研究被列入“七五”国家科技攻关计划2。为提高螺旋藻的生物量，国内外从营养物质、外界环境条件得各方面进行了大量的研究，并且取得了相当大的成就。现如今 我国螺旋藻养殖、开发单位已达到近 50 家，成为螺旋藻养殖大国，年产量在 1000t 以上，约占世界产量的 40%。 国内外已将螺旋藻广泛应用于食品、保健品、化妆品、医药、饲料等行业。 螺旋藻已被越来越多的人们了解和使用 .它将成为 21世纪最佳的营养食品和新型保健药品
13、。 螺旋藻作为一种高产优质、营养价值高的藻类资源逐渐被人们了解并接受。 迄今人2 们已在螺旋藻的引种驯化代谢调控和规模培养等方面进行了大量的研究 7,8 与其它生物一样，螺旋藻的生长、繁殖和外界生活条件密切相关。影响螺旋藻生长和物质组成的因素主要有几个方面，如温度、光照、 pH 值和碳酸盐类 9。 pH值大幅度上升是螺旋藻培养过程中培养液的最 显著变化， pH值升高主要是螺旋藻光合作用从培养液中吸收 CO2所致 10。一方面 ,对碱性环境的需求是螺旋藻的生理特性 ,同时 ,较强的碱性可以创造一个选择性的环境 ,有利于防止其它微生物的污染；另一方面 ,pH值的不断升高又会对螺旋藻的生长繁殖产生不
14、利影响 ,甚至导致培养的失败。控制培养液的 pH值 ,是连续培养螺旋藻 ,特别是工厂化生产螺旋藻的一个关键 11,12。 光是影响植物光合作用过程的主要因素 ,而光照时间的长短直接影响植物生长及其产量。螺旋藻是一种生活在水中的光能自养植物 ,人工养殖的螺旋藻是生活在人工配制的营养 液中生长的 ,通过光合作用制造有机物 ,光能利用率决定着植物的光合生产力。据报道 13, 每日光期和暗期的交替是环境的普遍现象 ,低等藻类生物同样对之适应 ;因而螺旋藻的生长过程也是如此。所以 ,在培养螺旋藻时 ,宜选用适宜的光照时间长度 ,以提高藻的产量及其蛋白质含量。 温度同光照一样是影响螺旋藻代谢活动的重要因子
15、，温度主要从暗呼吸和光合作用两方面影响螺旋藻的生长。因为光合作用过程中的暗反应是由酶所催化的化学反应，温度直接影响到酶的活性。在低温中，酶促反应下降，故限制了光合作用的进行。高温光合作用降低的原因一方面是高 温破坏叶绿体和细胞结构，并使叶绿体的酶钝化，另一方面是呼吸速率大于光合速率，不利于生物量的积累 14。文献 15还提出温度通过与其他因素的相互作用而影响螺旋藻的生长。 本实验以 中国海洋大学海洋生命学院提供的钝顶螺旋藻藻种为材料，设置一系列pH、温度、光照条件梯度， 研究在不同条件下螺旋藻的生长状况，通过分光光度法测定藻密度。并最终通过分析实验所得的数据，总结螺旋藻的生长规律。 3 1 材
16、料与方法 1.1 实验材料 1藻种： 2010 年 3 月中国海洋大学海洋生命学院提供 500ML 钝顶螺旋藻藻种，放置冰箱内冷藏。 2培 养基： Zarrouk 培养液配方如表 1-1 表 1-1 螺旋藻培养液 Tab.1-1 Composition of solution for Spirulina 成分 浓度（ g/L） NaCl 0.1 MgSO4 1.0 NaNO3 2.5 K2SO4 1.0 NaHCO3 16.8 EDTA 0.08 CaCl2H 2O 0.04 FeSO47H2O 0.5 K2HPO43H2O 0.5 A5 微量元素混合液 1ml B6 微量元素混合液 1ml
17、蒸馏水 1L 按照体积比 1:2 转接 3其他试剂： 2.0molL 的盐酸溶液， 2.0molL 氢氧化钠溶液。 4 4仪器与设备： 表 1-2 实验设备 Tab.1-1 Experimental equipment 仪器 名称 仪器型号 仪器出厂地 灭菌锅 NaCl 26.518 分光光度计 MgCl2 2.447 微生物培养箱 MgSO4 0.305 干燥箱 CaCl2 0.725 表 1-3 实验器材 Tab.1-1 Laboratory Items 需要高压灭菌锅灭菌 无需高压灭菌锅灭菌 器材名称 个数 器材名称 个数 150ML 的锥形瓶 50 个 报纸 数张5ML 移液管 4 个
18、 绳子 20 米 玻璃棒 3 个 滤纸 一盒 2000ML 玻璃瓶 1 个 PH 试纸 三种各一盒 50ML 量筒 3 个 酒精灯 1 瓶 5 1.2 实验方法 1.2.1 实验前期准备 1.藻种保存：将钝顶螺旋藻藻种放置冰箱内冷藏，保持温 度在 18 左右 2.锥形瓶：首先将实验中需要用到的锥形瓶全部洗干净晾干。然后准备数张报纸和数根长度大约在 0.3 米的绳子。最后将牛皮纸套在锥形瓶上，用绳子绑紧。 3.蒸馏水：取容量 2000ML的玻璃瓶洗干净并用蒸馏水润洗，装入 2000ML蒸馏水。准备一张报纸和一根长度大约 0.6 米的绳子。将牛皮纸套在玻璃瓶上，用绳子绑紧。 4.其他需要灭菌器皿：
19、取足够大的报纸数张，将剩余需要灭菌的器皿用报纸包住，并用绳子在报纸外面绑紧。 5.高压灭菌：将所有包好的器皿放进高压灭菌锅，设置温度为 121 ，灭菌时间设为 30 分钟。等 灭菌锅停止后取出后放入干燥箱内烘干。 1.2.2 不同 pH 下对螺旋藻吸光度的测量 在 150 ml的锥形瓶中加入 50 ml的 Zorrouk 培养液，再加入 5 ml活化后的浓缩藻液摇匀，使用 2mol/L 的 HCl或 NaOH 溶液调节 pH 值分别为 2.0、 4.0、 6.0、 7.0、 8.0、9.0、 10.0、 11.0、 12.0，同时做一组平行实验。将所有配备好的锥形瓶在光照培养箱中选择光照 3k
20、lx，温度 25下培养。每天下午 4 点用 721 分光光度计、 1.0cm比色杯，在波长 560nm处测量藻液的光吸收值（光密度值），并记录数据。 1.2.3 不同温度 下对螺旋藻吸光度的测量 在 150 ml的锥形瓶中加入 50 ml的 Zorrouk 培养液，再加入 5 ml活化后的浓缩藻液摇匀。将所有配备好的锥形瓶在光照培养箱中调节温度分别为 15、 20、 25、30、 35、 40，并设定光照为 3 klx，同时做一组平行试验。每天下午 4 点用 721分光光度计、 1.0cm 比色杯，在波长 560nm 处测量藻液的光吸收值（光密度值），并记录数据。 1.2.4 不同光照时间下对
21、螺旋藻吸光度的测量 在 150 ml的锥形瓶中加入 50 ml的 Zorrouk 培养液，再加入 5 ml活化后的浓缩藻液摇匀 。将所有配备好的锥形瓶在光照培养箱中保持 25的条件，光照在 3klx。分别调节光照在 4 小时、 8 小时、 12 小时、 16 小时、 20 小时，同时做一组平行试验。用721 分光光度计、 1.0cm 比色杯，在波长 560nm 处测量藻液的光吸收值（光密度值），并记录数据。 6 2 实验结果与分析 2.1 pH 对螺旋藻生长的影响 Zarrouk 培养基的 pH 值为 8.7 左右。在培养过程中 pH 值会随着基础培养基的组成、 培养条件及藻类繁殖代谢而不断波
22、动，如果培养液的 pH 值偏高或偏低，螺旋藻的生长繁殖和产物积累就要受到显著影响。为探讨 pH 值对螺旋藻生长的影响，在接入藻体后分别将培养液的 pH 值调节为 2.0、 4.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0、 12.0，其生长情况如下图 2-1 所示。 图 2-1 PH对螺旋藻生长密度的影响 Fig.2-1 PH of the influence of spirulina density of growth 注：第一天代表螺旋藻在 PH 在 2-12 时第一天的生长情况， 第二天代表螺旋藻在 PH 在 2-12 时第二天的生长情况 , 第三天代表螺旋 藻在 PH 在 2-12 时第三天的生长情况 , 第四天代表螺旋藻在 PH在 2-12时第四天的生长情况 , 第五天代表螺旋藻在 PH 在 2-12时第五天的生长情况 , 第六天代表螺旋藻在 PH在 2-12时第六天的生长情况。 PH对螺旋藻密度的影响 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 0 2 4 6 8 10 12 14 PH 吸 光 度 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天
