1、 本科 毕业设计 （ 20 届） 进出口水果中氯吡脲（比效隆）残留量的检测方法 所在学院 专业班级 化学工程与工艺 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 1 摘要 ： 近年来苏丹红，三聚氰胺等事件使食品卫生备受关注，对食品检测的要求也越来越高，本文介绍了用高效液相色谱 串联质谱法 测定西瓜、葡萄、猕猴桃中的氯吡脲含量。试样经乙腈提取、分别用丙基乙二胺 (PSA)或 C18或硫酸镁分散固相萃取 (DSPE)净化后在 C18柱上以甲醇与 5m mol 乙酸铵水溶液 (体积比为 90:10)为流动相进行分离 ,在 260 nm 波长下检测。氯吡脲的检出限为 0.01 m g/kg,在 0
2、.05-0.20mg/L 时线性关系良好 (r=1.000)。试样在0.01,0.05,0.10mg/kg 三个添加水平的回收率为 85.2%-105.1%,相对标准偏差 (RSD)为2.51%-8.95%。该方法简便快速 ,准确灵敏 ,适合大 批量样品的快速处理。 关键词： 高效液相色谱 质谱法；氯吡脲；西瓜；猕猴桃；葡萄。 2 Abstract： In recent years Sudan red, melamine events such as the food hygiene, much attention to food testing requirements for more a
3、nd more is also high, this paper introduces using high performance liquid chromatography (HPLC) tandem mass spectrometry determination watermelon, grape, the forchlorfenuron content. Sample respectively by acetonitrile extraction, with propyl ethylenediamine (PSA) or dispersed C18 or magnesium sulfa
4、te solid-phase extraction (DSPE) after purification in using C18 column on 5mmol ammonium acetate methanol（ The volume ratio for 90:10） and solution as mobile phase separation, in 260 nm wavelengths detection. forchlorfenuron detection limit for 0.01 m g/kg, in 0.05-0.20 mg/L linear relationship whe
5、n good (r = 1.000). Sample in 0.01, 0.05, 0.10 mg/kg three add level of recovery of 105.1% efficiency - and relative standard deviation (RSD) for 2.51% gain - 8.95%. This method is simple and rapid, accurate sensitive, suitable for mass fast sample processing. Keyword ： High performance liquid chrom
6、atography (HPLC) mass spectrometry; forchlorfenuron ; Watermelon; Kiwi; Grapes. 3 目 录 摘要 . I Abstract. 2 1 绪论 . 4 1.1 选题意义 . 4 1.2 氯吡脲在农业上的应用 . 5 1.3 氯吡脲的一些已知检测方法 . 6 1.4 农残分析技术的发展趋势 . 7 2 试验部分 . 8 2.1 试验流程 . 8 2.2 分析方法 . 8 2.2.1 仪器设备 . 8 2.2.2 试剂与材料 . 9 2.2.3 样品前处理 . 9 2.2.4 净化 . 9 2.2.5 仪器条件 . 9 2
7、.3 实验内容 . 10 2.3.1 氯吡脲的稳定性 . 10 2.3.2 净化条件的选择 . 10 2.3.3 PSA、 C18、无水硫酸镁用量的确定 . 11 3 结果与分析 . 12 3.1 线性关系 . 12 3.2 高效液相色谱 串联质谱图 . 12 3.3 方法的准确度 . 15 3.4 方法的精密度 . 16 结论 . 18 参考文献 . 19 致谢 . 错误 !未定义书签。 4 1 绪论 1.1 选题意义 由于农药的使用会导致药物的滞留或积蓄，并以残留的方式进入人体及生态系统，从而对人类生命健康和环境造成一定的危害。由于我国对农用化学品的生产、 使用的管理混乱和惩治力度不够，加
8、之农业科学技术普及程度较低，使得过量使用、滥用或误用农药而导致农作物、牲畜、土壤、水和大气中农药残留超标的问题日趋严重，甚至因无意食用农残超标的食品而导致急性中毒乃至死亡的事件也有发生， 2006 年 8 月 2 日，浙江省台州市卫生局在某油脂厂内查扣原料油 38600 公斤、成品油 5300 公斤 。经疾病预防控制中心抽样检测，猪油中酸价和过氧化值严重超标，浙江省疾病预防控制中心还检出内含剧毒的六六六 和 滴滴涕 。 2008 年 8 月，人造 新鲜红枣 流入乌鲁木齐市场。主要经过两道工序，铁锅里放 进酱油，使青枣变成红色，并保持光泽。再次放进加入大量糖精钠和甜蜜素的水池中浸泡，使其口感泛甜
9、。过量食用会造成血小板减少，酿成急性大出血等直接身体危害。 2003 年 11 月 16 日， 金华火腿敌敌畏 事件被曝光，金华市的两家火腿生产企业在生产 反季节腿 时，为了避免蚊虫叮咬和生蛆在制作过程中添加了剧毒农药敌敌畏。金华火腿的销量几乎为零，金华市经营千年的城市名片瞬间蒙垢 。上述所说的事件都 已严重威胁到我国人民的身体健康。 氯吡脲 (forchlorfenuron)，商品名为吡效隆，化学名称为 1 (2-氯 4吡啶基 ) 3苯基脲 【 1、 2、 3】 。氯吡脲是苯基脲类衍生物 ,属高效、低毒植物生长调节剂。其作用机理与嘌呤型细胞分裂素相同 ,但活性更高 【 4】 。氯吡脲能促进细
10、胞分裂、分化和扩大 ,促进器官的形成和蛋白质的合成 ,增强水稻抗逆性和延缓衰老 ,可促进瓜果类植物花芽分化 ,防止生理落果 ,提高座果率 ,对猕猴桃、葡萄、西瓜和黄瓜等作物增产效果极其显著 是一种广泛应用于农业生产的新型高效植物生长调节剂 【 5,6.7】 。 又因氯吡脲的消解时间不是很长，所以以后它在农业上可能得到广泛应用。但 因氯吡脲可能会对人体带来潜在的健康危害，故研究良好的氯吡脲检测 方法具有重要的实际意义。 5 图 1 氯吡脲分子结构图 1.2 氯吡脲在农业上的应用 它属于苯脲类细胞分裂素，其生理作用主要有； (1)促进细胞分裂，扩大细胞体积； (2)促进器官形成和蛋白质的合成； (
11、3)增强抗逆性、延缓衰老； (4)打破顶芽优势； (5)诱导休眠芽的生长； (6)促进坐果、果实膨大； (7)提高光合作用效率； (8)诱导单性结实。其生理作用与一般嘌呤类细胞分裂素类似，但作用浓度更低，活性更高。浓度高时还可以用作除草剂。 LD50大白鼠急性经口 4918mg kg，兔急性经皮 2000mg kg，鹌鹑 2250mg kg，虹鳟鱼LC50(96h)为 9.2mg kg，水虱 EC50(48h)为 8.0mg kg【 8， 9】 。 氯吡脲能显著促进葡萄，猕猴桃，黄瓜等多种水果及蔬菜的果实膨大，提高作物的产量，在各个方面得到广泛应用。孙瑞红，苑克俊等 【 5】 用 3.3mg
12、kg 14 3mg kg处理葡萄，平均单果重比对照增加了 O.509 1.069，增产效果达到 20.2。秦仲麟用吡效隆和猕猴桃果王液两种调节剂处理猕猴桃，结果显示用吡效隆 I号处理的平均单果重比对照高 17.643.9，达显著性差异，以 50倍液处理的效果最 显著，平均单果重比对照高 43 9。用猕猴桃果王液处理，平均单果重比对照高 9.3 21.7，仍以 50倍处理的增大效果最明显平均单果重比对照高 21.7。吡效隆 I号的增大效果比猕猴桃果王液更为显著 【 10】 。然而氯吡脲的膨大效果也与果实的花期有关， J G.Cruz-castillo等研究表明，当用 15uL lCPPU处理不同
13、的猕猴桃花时，开花早的结出的果实 (153g)较开花迟的果实 (126g)大，花前的因素与早期果实的生长是决定最终果实大小的关键 【 11】 。 由于其生长促进作用效果优异，因而被广泛应用于苹果， 葡萄，甜瓜，猕猴桃，苦瓜，黄瓜，桑树，烟草，水稻，大豆等多种作物上。如按平均增产 15计算，每年农产品增收产值可达数千万元。 6 1.3 氯吡脲的一些已知检测方法 色谱分析法作为一种分离技术，是由俄国植物学家在 1906年创立的，发展至今，已有将近百年的历史。色谱分析法原理是不同物质在两相 (固定相和流动相 )中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次分配，从而使分配系数只有
14、微小差别的组分得到分离。液相色谱法是以液体为流动相的色谱分析方法。迄今，液相色谱法已广泛应用于化工、医药、农业、环境监 测等领域，在水质、大气、土壤、有机化工、食品、生物等方面已应用于实际指标分析。 目前，关于氯吡脲残留分析研究方面的报道较少，且都采用液相色谱分析方法 【 12】 。Sharma 等采用液相色谱法检测了氯吡脲在葡萄上的残留消解动态 【 13】 ，采用乙腈提取，正己烷和二氯甲烷液液分配，高效液相色谱法 (UV)检测，在葡萄、土壤和水中添加 0.05 mg kg和 0.1 mg kg 的回收率分别为 78 81、 88 90和 90 92。澳大利亚农药和兽药局发布了氯吡脲在葡萄上的
15、残留分析方法 【 14】 ，采用甲醇或甲醇一水 (体积比 1： 1)提取。液一液分配净化。高效液相色谱法 (UV)检测，氯吡脲在葡萄中的最小检出质量分数为 0.00 1 mg kg。陈长龙，李建中，王会利，胡继业建立了氯吡脲在土壤西瓜中残留的 HPLC分析方法 【 15】 。 西瓜采用乙腈提取， PSA 柱净化，土壤采用乙腈提取， C18 柱净化 ,氯吡脲的添加回收率大于 95%，变异系数小于 10%，最小检出浓度为 5ug/Kg，检出限为 0.4ng。对西瓜消解动态的研究表明，氯吡脲在西瓜中消解比较快，半衰期为 1.20 1.67d；使用剂量为 20 30mg a.i/kg水溶液于雌花开放当
16、天或前后 一天均匀喷洒西瓜胎一次，西瓜收获时（施药后 40d），样品中未检测出氯吡脲残留 .土壤消解动态研究表明：使用 600mg a.i.hm-2的剂量对土壤喷雾，氯吡脲在土壤样品中的半衰期为 9.87 15.3d；使用 300 600mg a.i.hm-2的剂量对土壤喷雾，西瓜收获时（施药后 40d），土壤中未检测出氯吡脲残留。 胡江涛等采用乙腈提取和 PSA 分散固相快速萃取 【 16】 ，反相高效液相色谱法测定了氯吡脲在猕猴桃中的残留，检出限为 0.005 mg L。添加回收率在 82.0 ll2.0之间。 2007年高立民等 【 17】 利用反相液相色谱法测定氯吡脲含量。采用二极管阵
17、列检测器和 C18色谱柱的高效液相色谱仪 ,以对羟基苯甲酸丙酯为内标 ,以甲醇 +纯水 (60+40 V/V)做为流动相 ,在检测波长为 260 nm、流速为 0.8 mL/min条件下 ,氯吡脲、内标物和杂质能较好的分离。该方法的线性相关系数为 0.999958,回收率范围 99.49% 100.48%,平均值 99.93%,变异系数 0.58%。该方法具有样品准备简单 ,分析速度快等优点 ,可以用于氯吡脲产品中有效成分的测定。 李佳，龚道新建立了氯吡脲在7 土壤和黄瓜中残留的 HPLC分析方法 【 18】 。氯吡脲的添加回收率大于 80，变异系数小于 12，最小检出浓度为 3.75 10-
18、3 mg/kg，检测限为 3.0 10-10 g。对黄瓜消解动态的研究表明，氯吡脲在黄瓜中消解较快，半衰期为 5.50 7.61d；黄瓜收获时 (施药后 40 d)，样品中未检出氯吡脲残留。土壤消解动态研究表明：氯吡脲在土壤样品中的半衰期为 6.54 8.39d；黄瓜收获时 (施药后 40d)，土壤中均未检出氯吡脲残留。朱培芳，刘玉林建立了一种用高效液相色谱法 (HPLC)测定氯吡脲 (又称 CPPU)的方法。采用 ZOSAX Extend C18柱，流动相为乙腈和水，检测波长为 245nm。本方法分离效果好，准确度、精密度高，重现性好，操作简便，准确、快速，适宜于生产过程中的质量控制。 美国
19、农业部农业研究服务中心的 Anastassiades M 等开发了一种快速、简便、价格低廉的预处理方法来实现高质量的农药多残留物分析，该法被简称为 QuEChERS 法 【 19】 。该法已在世界各国得到广泛应用， 2006 年欧盟委员会制定了相应的 SANCO 操作指南。 QuEChERS是英文字母 QuickEasyCheapEffectiveRugged and Safe 的缩写，即快速、容易、便宜、有效、稳定和可靠。其主要步骤是用乙腈对放入聚四氟乙烯离心管的样品进行浸提，再加入无水硫酸镁与氯化钠振荡，离心促使其分层，随后进行分散固相萃取，即将浸提液转移至含有 PSA 等吸附剂和硫酸镁的
20、聚四氟乙烯离心管中，离心后取上清液进行测定。同时本方法也可根据可供选择的分析仪器种类、检测限、靶标农药的范围以及使用介质的差异进行适当调整。有超过 200 种农药残留可用该法分析，其中包括含脂肪的介质体系。 QuEChERS 法不仅在农产品农药多残留物检测的样品预处理中得到广泛应用，而且已拓宽到环境样品 农药多残留物检测，农产品兽药检测以及生物样品药物检测的预处理。由于 QuEChERS 法操作简单、价格低廉、有机溶剂消耗少，高效，可以获得较干净的萃取样品，所以能够胜任 MS检测器分析数百种农药残留物的要求。若将 QuEChERS 法中的萃取溶剂乙腈换成乙酸乙酯，可适用于 GC/NPD 或 F
21、PD 或 ECD 检测。 1.4 农残分析技术的发展趋势 目前，农药残留分析总的发展方向和趋势有以下几个方面： (1)传统实验室的分析模式将被分成两步分析模式代替。即先应用简便、快捷的分析方法进行现场快速初测，如免疫分析技术、生物传感器等 ，对检测呈阳性反应的样品进行实验室进一步确证。 8 (2)随着人类对蔬菜食品质量要求的提高，加上检测技术的不断进步，使农药残留检出的灵敏度大大提高。新的蔬菜食品残留检测下限必须低于最大允许残留量，因此，先进的前处理方法和仪器，更加灵敏的检测仪器将得到更广泛的应用。 (3)前处理工作正向着省时、省力、低廉、减少溶剂、减少对环境的污染、系统化、规范化、微型化和自
22、动化方向发展；各种在线联用技术可避免样品转移的损失，减少各种认为的偶然误差，将是农药残留分析方法研究的重点。 (4)生物技术与现代理化分析手段相结合不断开发 出新的分析技术，对于极性强、难挥发、热不稳定、易分解的农药残留分析有着得天独厚的优势，发展迅速，前景诱人。 (5)现在使用和生产的都是化学农药，其主要成分都是分子量较小的有机物，今后生物源农药将代替化学农药，分析重点将转向与生物组织成分很难区分的生物氯毗脲的残留分析方法及残留动态研究大分子农药，因此未来的分析工作者必须掌握细胞化学、发酵化学、免疫化学等方面的基础知识 【 20】 。 2 试验部分 2.1 试验流程 取样 打碎 称样 10.
23、0g 加乙腈 20.0ml 匀浆 加 NaCl至饱和 离心 取上清液 旋蒸 溶解净化 稀释进样。 2.2 分析方法 2.2.1 仪器设备 高效液相色谱 串联质谱仪 （紫外检测器）美国 Agilent公司生产； 旋转蒸发器 (LABOROTA4003-contr01)德国 Heidolph公司生产； 电子天平 (AE240S， PC4000)瑞士梅特勒托利多仪器有限公司生产； 9 氮吹浓缩仪 (N E址刑 112)美国 Organomation associates公司生产； 高速匀浆仪 (ULTRA-TURRAXT25 basic)德国 IKA-WERKE公 司生产； 涡旋混合器 (GENIU
24、S 3)德国 IKA-WERKE公司生产； 离心机， 5ml针筒若干，离心管、广口瓶、试瓶、容量瓶、圆底烧瓶、移液管等玻璃仪器若干； 2.2.2 试剂与材料 新蒸二次蒸馏水，丙酮，甲醇，氯化钠，乙腈（色谱纯）， C18，无水硫酸镁， PSA。氯吡脲标准样品 (德国 Dr Ehrcnstorfer GmbH公司生产 ) 2.2.3 样品前处理 以葡萄样品基质为例，准确称取两份试样 10.0 g（精确到 0.01 g）分别于 50 mL 离心管中，分别编号 1,2。在 1 中加入 0.04 ug/ml氯比脲标准品 1 ml。两份样品中都准确加入 20 mL 乙腈，在匀浆机中高速匀浆 1 min，加入氯化钠至饱和，于 3000 r/min 离心 3 min。移取上清液于平地烧瓶中，旋蒸蒸干。加入 2 ml甲醇待用。 2.2.4 净化 将上述溶液移至鸡心管中分别加入净化剂 :PSA、 C18、无水硫酸镁 100mg 涡旋 1min后离心，取 1 ml溶液至干净的鸡心管中，氮吹吹干，用甲醇 水溶液（体积比 60:40）溶解并定容至 1 ml，过膜（ 0.45um孔径），待测。 2.2.5 仪器条件 监测离子 对及电压参数： a) 电离方式：电喷雾电离 （ ESI） ； b) 电喷雾电压： 4 000 V； c) 鞘气 压力： 40 Psi； d) 辅助气 压力 ： 20 Psi；
