1、 本科 毕业设计 （ 20 届） 不同产地杭白菊核磁共振指纹图谱的研究 所在学院 专业班级 化学工程与工艺 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 1 摘要： 杭白菊（ Flos Chrysanthemi），为菊科植物菊的干燥头状花序，具有 平肝、清热、解毒、消炎等多种功效。含有木犀 草素 -7-D-葡萄糖苷、芹菜素 -7-D-葡萄糖苷、金合欢素 -7-D-葡萄糖苷等多种黄酮类有等成分，早期研究发现菊花具有解热、抑菌、抗流感病毒、抗心血管、抗炎等作用。为了进一步规范杭白菊用药、比较杭白菊药材的内在品质和鉴别特征，本文通过核磁共振对从不同产地的杭白菊总黄酮（ CFE）进行了指纹图谱及成
2、分分析的研究，为杭白菊与制剂的鉴别及其质量控制提供依据。 关键词 ：杭白菊；核磁共振；总黄酮；指纹图谱。 Abstract： Flos Chrysanthemi， anthotaxy of Chrysanthemi morifolium Ramat， with pinggan， heat， detoxification， antiinflammatory and other effects.And it is a rich source of secondary compounds（ including iuteolin-7-D-glucosid； apigenin-7-D-glucosid
3、and acacetin-7-D-galactopyranoside） with a variety of biological activities.For example， it can also inhibit the agglutination of blood platelet and promote the myocardial blood circulation and white cell phagocytosis.In order to ensure authenticity， quality， safety and efficacy of the Flos Chrysant
4、hemi， CFEof Flos Chrysanthemi of different sources，Fingerprint were analyzed by using NMR which can be used identifying methods for Flos Chrysanthemi， and also be used to control quality of CFE and tablet of CFE. Keywords： Flos Chrysanthemi； NMR； CFE； fingerprint. 2 目 录 Abstract . 错误 !未定义书签。 一 绪论 .
5、错误 !未定义书签。 1 选题背景、意义 . 错误 !未定义书签。 2 相关研究的最新成果和动态 . 4 二 实验部分 . 7 1 技术路线 . 7 2 实验方法 . 7 2.1 仪器与材料 . 7 2.2 实验步骤 . 7 2.3 样品总黄酮提取 . 7 2.4 解析指纹图谱 . 7 三 结果与分析 . 8 1 各提取物碳谱 . 8 2 各提取物氢谱 . 11 结论 . 14 致谢 . 14 参考文献 . 15 3 一、绪论 1.选题背景、意义 中医药作为中华民族科学、文化和历史的伟大宝库。是我国在自然科学领域最有优势、最有特色、最有希望的学科之一。中药产业也应是我国国民经济中新的经济增长点
6、。随着21世 纪的到来和我国加入 WTO，国际医药产业竞争日益激烈，国际经济一体化对传统中药产业提出了现代化、国际化的要求，我国中药产业面临严峻挑战。 随着中药现代化、国际化，迫切需要建立一种对中药产品从原料到成品进行质量控制以及对中药复杂成分检出的方法，中药指纹图谱的建立是必须的。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它是建立在中医化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药指纹图谱是借用 DNA指纹图谱发展而来。最先发展起来的是中药化学成分色谱指纹图谱，特别是高效 液相色谱（ HPLC）指纹图谱。HPLC 具有很高的分离度，可把复杂
7、的化学成分进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图，这些色谱峰的高度和峰面积分别代表了各种不同化学成分和其含量。由此可见，中药指纹图谱比 DNA指纹图谱更进一步的发展在于 ：不但有特征的体现 (各种化学成分的个数和相对位置 保留时间 )可作定性鉴别使用，还体现了量的概念。峰的高度和峰面积表示了某个化学成分的含量，而各峰的峰高 (或峰面积 )的比值体现了各种化学成分间的相对含量；量的概念的引入、定性和定量的结合赋予中药指纹图谱更大的功效；中药指纹图谱不仅可 以进行个体、某物种的 “唯一性 ”的鉴定，还可以将其 “量 ”的特征和其他体系挂钩。 中药指纹图谱定义为运用现代分析技术对中药化学信息以图形
8、（图像）的方式进行表征并加以描述。中药指纹图谱全面反映中药内在化学成分的种类与数量 , 进而对药品质量进行整体描述和评价。这也正好符合中医药整体学说。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。总之，中药指纹图谱的研究和建立，对于提高中药质量，促进 中药现代化 具有重要意义。 杭白菊 (Flos Chrysanthemi)又称甘菊、茶 菊、药菊、白菊花，为菊科植物菊（ Chrysanthemummorifolium Ramat )的干燥头状花序，为卫生部首批批准的药食同源的药材，与贡菊、毫菊、滁菊被中国药典 2005版收载予菊花品种中。杭白菊
9、，神农百草经4 中列为上品，是著名 中药材“浙八味”之一，其性微寒，味微甘，含有多种对人体有益的成分，具有平肝、清热、解毒、消炎等多种功效，是中医处方一味常见的良药，也是菊花散、杞菊地黄丸等传统名配方的主要成分。 杭白菊除了能入药外，也有点茶、酿酒、作枕、沐浴等多种用途。很多人爱泡杭白菊饮用，其色淡黄清 亮，其味清新飘逸，其性柔和甘爽，久服利气血、轻身、耐劳延年。用杭白菊做枕芯，清香宜人，能助睡眠、解疲劳、抗感冒，还有保持血压稳定等作用 现代科学研究发现，菊花含有菊花苷、腺嘌呤、维生素 B1、挥发油等成分，对流感病毒、金黄色葡萄球菌、链球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等病原体有抑制，白菊花的浓缩煎剂对
10、冠心病有治疗作用。 为了更充分合理地开发与利用杭白菊药材，保证杭白菊药材的质量，优化和稳定生产工艺，控制中间体与成品的一致性，特对杭白菊进行指纹图谱研究。 2.相关研究的最新成果与动态 中药指纹图谱技术包括光谱、色谱、核 磁共振、 X 射线衍射、 DNA 指纹图谱及各种技术的联用 2.1光谱指纹图谱 2.1.1红外光谱（ IR）指纹图谱 近年来，用红外指纹图谱法鉴别中药的研究较多，在中药标准的构建中也发挥着相当重要的作用，尤其是这一技术作为中药鉴别的辅助手段，发展较快。红外光谱的优点是“多快好省”，是一种绿色分析技术；缺点是这种方法不是“原始方法”，很难作为标准方法，且需要大量代表性样品进行化
11、学分析建模。 2.1.2紫外光谱（ UV）指纹图谱 紫外光谱能够给出药效物质基础的结构信息，但所给出的信息是所有化学物质结构信息的加和，不具备指纹 特征，但可作为中药指纹图谱研究的辅助方法。皱华彬等 3采用共有峰率和变异峰率双指标序列分析法对不同产地、不同采集年份的白芍样品及相近指纹赤芍、丹皮样品进行了定量评价。该法可以对至少 2个样品进行定量评价，克服了多种中药鉴别方法5 只能进行真伪鉴别、产地鉴别的局限性，为中药质量的准确定量评价提供了一种方法。 2.2色谱指纹图谱 2.2.1薄层色谱（ TLC） 指纹图谱 薄层色谱法（ TLC） 一开始一简单快速的鉴别为起点， 20 世纪 60 年代后很
12、快取代了纸色谱技术，至今在中药鉴别中应用频率仍然最高，近年来发展的 TLC自动扫描 仪，用固定波长对薄层的各个斑点作扫描的图谱比目测的层析图谱更为可观准确，也具有更好的指纹鉴别意义。 2.2.2高效液相色谱（ HPLC） 指纹图谱 高效液相色谱（ HPLC） 作为最常用的指纹图谱研究方法，具有分离效能高、选择性高、检测灵敏高、分析速度快、应用范围广等特点。中药样品中含有的成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，方法成熟，是目前指纹图谱研究应用最多的一项技术。 2.2.3气相色谱（ GC） 指纹图谱 气相色谱法（ GC） 主要用于分析气体、挥发性和半挥发性液体以及能够产生足够蒸气压的固体，
13、或者沸 点在 500以下，相对分子质量 400以下的物质。在中药质量控制中主要用于挥发油、极性较小的成分或衍生化后的可挥发性成分（如脂肪酸的酯）。 GC 的特点是灵敏度高、分离度好、分析速度快。定量分析的精密度优于 1%。 2.2.4色谱联用技术 2.2.4.1高效液相 /质谱联用（ HPLC/MS） 指纹图谱 液质联用技术对被测化合物的确认有很高的可信度，具有灵敏度高、选择性好、精密度高等优点，而且 HPLC/MS有易于操作和自动化的特点。目前此项技术已经成为制药业、药物分析与研制领域十分重要的分析方法。 2.2.4.2气相色谱 /质谱联用（ GC/MS）指纹图谱 气相色谱作为进样系统，将待
14、测样品进行分离后直接导入质谱进行检测，既满足了质谱分析对样品单一性的要求，还省去了样品制备、转移的繁琐过程，不仅避免了样品受污染，对于质谱进样量还能有效控制。质谱作为检测器，检测的是离子质量，获得化合物的质谱图，解决了气相色谱性的局限性。 6 2.3核磁共振氢谱 (NMR)指纹图谱 核磁共振氢谱 (NMR)是鉴定有机化合物结构的重要方法之一 ,可以获得化合物中包括各类质子的化学位移、数量、偶合关系等多个结构信息。植物类中药的特征性化学成分的含量是相对固定的 ,在规范的提取分离条件下 ,植物类中药的 HNMR 图谱与植物品种则存在着严格的对应关系 ,没有混淆的可能性 ,图谱中的信号强弱反映了混合
15、物中各组分的相对含量 ,在对特征性提取物进一步分离得到单体后 ,通过结构鉴定和 HNMR 研究 ,可以对指纹图谱中的各特征谱线进行归属。 HNMR 指纹图谱以其良好的单一性、全面性、定量性、易辨性、明显的特征性和良好的重现性 ,预示了其在中药鉴定中的应用前景。 2.4X射线衍射 (XRD)指纹图谱 中药材的 XRD 图谱是药材中所含各种成分的衍射谱的叠加 ,从整体上反映一般成分和主要成分的分布概况 ,从而可 能提供较全面的有鉴别意义的数据。 20 世纪 80 年代末 ,X 线衍射法在我国开始用于中药鉴定。目前 ,我国要求一类和二类中药新药要附有粉末 X线衍射谱。 2.5DNA指纹图谱 DNA
16、分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点 ,且不受生长发育阶段、供应部位、环境条件的影响 ,已在中药鉴定学研究中展示了良好的应用前景 ,并保持了强劲的发展势头。 7 二、实验部分 杭白菊含有菊花苷、腺嘌呤、维生素 B1、挥发油多种有效成分，本次实验采用 NMR 法对 不同产地杭白菊总黄酮进行核磁共振指纹图谱的研究，为杭白菊药材的鉴别以 及质量评价提供依据。 1.技术路线 2.实验方法 2.1仪器与材料 仪器：旋转蒸发仪，包括旋转马达、蒸发管、真空系统、流体加热锅、冷凝管、冷凝样品收集瓶；水浴锅；冷凝管；烧瓶；粉碎机；量筒；电子天平。 试剂： 95%乙醇，蒸馏水 生物样品：采于山东济宁、广
17、东广州、浙江杭州、浙江桐乡 4地的杭白菊 2 2实验步骤 2.2.1用粉碎机粉碎杭白菊，精密称取杭白菊粗粉 50g，置于烧瓶中。 2.2.2加入 75%乙醇 228ml（ 95%乙醇 180ml，蒸馏水 48ml）， 置于 80C水浴中加热，装上冷凝管，观察冷凝管中是否有液体回流，待有液体回流时等待 30 60min后过滤。 2.2.3重复上述 2.2.2 操作 3次，取 3次过滤后的滤液合并，并于旋转蒸发仪中浓缩（流体加热锅设定为 40C），取浓缩液于试管中贴上标签。 2.3样品总黄酮提取 取不同产地样品，分别制备杭白菊总黄酮（ CFE）。 2.4解析指纹图谱 分别测定各提取物核磁共振氢谱和碳谱，以聚类分析和相似度分析比较总结杭白菊核磁共振75乙醇回流 不同产地杭白菊药材粗粉 象山、鄞县、磐安 、南通、东阳、缙云 CFE 13C NMR 测定 1H NMR 测定 相似度分析 相似度分析 8 特征指纹图谱。 三、结果与分析 1.各提前物碳谱 图 1 9 图 2 图 3
