1、 本科 毕业设计 （ 20 届） 层孔菌乙酸乙酯提取物的分离和纯化 所在学院 专业班级 化学工程与工艺 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 本文以 松针层孔菌乙酸乙酯提取物 为起始原料，以 硅胶柱 作为 分离柱 ，通过 用乙酸乙酯 、 石油醚 、 甲醛 ， 分离松针层孔菌乙酸乙酯提取物，通过气质联应用仪进行研究。 本文利用 1气质联应用仪 对产物进行了结构分析及表征，并研究了 提取物的组成 ，得到 最后物质。 关键词 : 松针层孔菌 ； 乙酸乙酯 ； 分离 II Abstract: Taking pine layer hole bacteria acetic est
2、er extract as the starting material, with silica column as separation column, through using ethyl acetate, petroleum ether, formaldehyde, separate pine layer hole bacteria acetic ester extract, through the temperament. Al application instrument This paper use 1 temperament league application apparat
3、us on product for structure analysis and characterization, and studied the composition, get last extract substan. Keywords: Pine layer hole bacteria ; Ethyl acetate; separation目 录 摘要 . I Abstract . II 1 绪论 . 1 1.1 选题的背景、意义 . 1 1.2 国内外研究动态 . 4 2 实验部分 . 4 2.1.1 试剂 . 4 2.1.2 仪器 . 6 2.2.1 硅胶柱 简介 . 8 2.2
4、.2 湿法分离 . 10 2.3 分离 路线设计 . 10 3 结果与讨论 . 11 4 结论 . 15 致谢 . 16 参考文献 . 17 1 1 绪论 1.1 选题的背景、意义 随着经济的发展，生活条件越来越优越，身体健康和保健因此引起了人们的高度关注。 蘑菇是营养功能性食品，也是为生理方面的有利医药的重要资源。他们生产出许多有趣生物活动的次生代谢产物，从而才有潜力用于药物发现的宝贵化学药品资源。有些蘑菇莫属纤孔菌和木层孔菌，例如纤孔菌，木层孔菌，木层孔菌，木层孔菌，作为治疗胃肠癌 ，心血管疾病，肺结核，肝或心脏病的传统医药 【 1】 ，尤其是 b葡聚糖，考虑到他们所负责的生物活性，有许多
5、关于多聚糖的隔离和生物活性都是来自药的蘑菇的学术报告。 松针层孔菌，或称松木层孔菌，是刺革菌科、木层孔菌属的一种真菌。拉丁学名： phellinuspini.。是针叶林里红野生松针层孔菌松、落叶松、云杉最主要的、危害最大的火立木腐朽菌，是针叶林的大敌，现已经由原始林逐渐侵染人工林 【 2】 层孔菌，对于针叶林无疑是一种癌，但是对于人类却是抑制肿瘤、治疗癌症的一剂良药。有人说，这是以毒攻毒，其实不对，因为松木层孔菌本身 无毒，名中医专家边同华先生的说法是扶邪 【 3。 子实体多年生，木栓质，无辆，菌盖扁米球形至马蹄形， 4-14 厘米 724 厘米，罕达23 厘米 40 厘米，厚 2.5-18.
6、5 厘米或更大。盖面初期有红褐色胶状皮壳 ，渐角质化而成灰色至黑色，并有宽的棱带，边缘往钝，初期近白色，后渐变淡黄色至赤粟色，下侧无子实层。菌肉近白色至淡黄褐色，有环纹，木栓质至木质。厚 0.5 2 厘米，味苦。菌管多层，每层厚 3 5 毫米，淡黄色，管口白色至乳白色。孢子卵圆形或椭圆形，无色。生于松、云杉、冷杉、铁杉及落叶松等针叶树的树干或朽木上。 偶尔也生于阔叶树的枯腐木上 【 5。 用于各种癌症，食道癌、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌等，可改善患者的症状，如增加食欲和体重、减轻疼痛，有时可见肿瘤缩小、胸腹水减少。可明显提高患者的细胞免疫功能，延长肿瘤患者的生存期，明显改善生存质量。子
7、实体含齿孔酸等活性物质，是所有真菌中治疗癌症效果最好的品种，子实体提取物对小白鼠肉瘤 180 及艾氏腹水癌的抑制率均达 100 【 6 （中国大型真菌原色图鉴 73 页记载。） 2 主治 用于治疗食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌等，可改善患者的症状如增加食欲和体重、减轻疼痛，有时可见肿瘤缩小、胸腹水减少。可明显提高患者的细胞免疫力功能，延长患者的生存期，改善生存质量。 3 1.2 国内外研究动态 1.2.1 中国科学家王稳航、 刘安军 等对松针层孔菌的药理作用进行了比 较系统的研究，结果显示：松木层孔菌三种多糖均不同程度地提高了小鼠血清、心、肝、脑、脾中 SOD、GSH-Px
8、 活力 ,降低了 MDA 生成量，而对 TOAC 值影响较小；同时，三种多糖均显著提高了小鼠体内血清 NO 生成量。结论：三种多糖的抗氧化机制可能与其它抗氧化剂不同，其对小鼠体内氧化压力和抗氧水平呈双重增加效果，可能是由于多糖作为免疫物质引起机体的免疫反应造成的。从 Phellinuspini 子实体中提取分离到一种水溶性多糖组分 PS1， “ 能提高正常和免疫低下小鼠的巨噬细胞吞噬能力。此外， PS1 能显著促进脾细胞体外增殖能力（ P 0.01 .结论：多糖 PS1 能显著提高机体的免疫能力，可作为一种生物效应调节剂应用于医药或保健食品领域 7 1.2.2 1.通过形态学 ， 生理生化特征
9、，以 ITs 序列分析 ,对实验室前期分离到的层孔菌 L8 菌株进行了鉴定，确定其为木蹄层孔菌（ GeneBank no.DQ 513402）。在明确菌种后，通过反复实验，构建了木蹄层孔菌 L8 的液体深层发酵培养方法 ， 并优化了其发酵工艺。结果表明当发酵培养基组成为 :葡萄糖 5%,蚕蛹水解液 1%，酵母粉 0.5%， KH2PO4 0.05%， MgSO4 0.05%；发酵条 件为 :温度 25 ，初始 pH 5.0，转速 100 rpm，通气量 1.0 vvm,接种体积 10%（ v/v） ， 发酵周期 6 天时 ，层孔菌 L8 的菌丝生物量最大 ， 可达 18.111.08 g/L，
10、 是优化前的 2.3 倍 8 。后荷瘤鼠的体重变化也可以看出，层孔菌 L8 的发酵菌粉给药后 ,荷瘤鼠的体重比给药前都有所增加。以上结果表明层孔菌 L8 的发酵菌粉 ,在肿瘤治疗方面 ,具有潜在的开发价值。 2.采用体外人源的肿瘤细胞作为筛选模型 ， 对 10 余种层孔菌进行了抗肿瘤活性评价和活性成分的分析 ， 结果发现 Hispolon 为一些层孔菌中共有的一个 活性成分 ,并发现 Hispolon 对许多肿瘤细胞表现出剂量依赖性的生长抑制作用 ,其中对胃癌细胞 SGC-7901 的活性较好，作用 72 h 后的 IC50 低于 10 g/mL9。 3.利用动态荧光可视技术，流式细胞术， W
11、estern-blot 等现代肿瘤细胞学和分子药理学的技术和方法 ， 深入研究了Hispolon 诱导胃癌细胞死亡的分子机理。结果发现 Hispolon 可以诱导胃癌细胞发生一种特殊的ROS 介导的线粒体途径的凋亡 10机制如下所述 ： Hispolon 通过将细胞内的 GSH 驱逐出细胞外 ,使得细胞内的 GSH 含量下降 ;同时抑制细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶 GPX 的活性 ,使得胃癌细胞的抗氧化能力大大下降 ,从而导致 ROS 的急剧增加。大量的 ROS 积聚引起了线粒体膜的氧化损伤，破坏了线粒体膜的完整性，导致线粒体膜的通透性增加，使得线粒体中的细胞色素 C 大量释放出来，激活了 Ca
12、spase 的级联反应 ， 启动凋亡程序 ， 最终引发细胞发生凋亡。相比之下 ， 当 Hispolon作用正常的胃粘膜上皮细胞后 ， ROS 并没有显著增加 ， 细胞也没有发生明显的死亡。探索造成这4 种差异的原因时 ,我们发现胃癌细胞本身固有的 ROS 水平比正常的胃上皮细胞要高 ,这使得胃癌细胞对 Hispolon 更加敏感。 10 4.低剂量的 Hispolon（ 2.5 g/mL）可以显著地增加化疗药物（丝裂霉素 C,5-氟尿嘧啶 ,阿霉素）对胃癌细胞 SGC-7901 的杀伤性。并且这种增敏机制是通过引发胃癌细胞中的 GSH 急剧下降 ,导致了 ROS 的大量积聚 ,进而引发了细胞死
13、亡。综上所述 ,本论文的研究结果为解决层孔菌类药用真菌的人工资源化问题 ,深入研究其活性成分的作用机制提供了一种思路和方法 ,并为层孔菌类药用真菌的新药创制提供了一定的依据。 11 2 实验部分 2.1.1 试剂 表 2-1 化学 药品一览表 序号 试剂 类型 来源 1 石油醚 AR(L) 上海 力明工贸 有限公司 2 乙酸乙酯 AR(L) 上海展云化工有限公司 3 硅胶 (S) 国药集团化学试剂有限公司 4 甲醛 AR(L) 国药集团化学试剂有限公司 表 2-2 主要试剂的物理性质 序号 名称 分子量 密度 g/cm3 熔点 沸点 形状 1 石油醚 60 90 无色液体 2 乙酸乙酯 118
14、.97 -83.6 77.2 无色液体 3 硅胶 60.08 白色粉末 4 甲醛 30.03 -118 -19.5 无色液体 2.1.2 仪器 表 2-3 主要仪器一览表 序号 名称 型号 来源 1 2 气质联用仪 旋蒸仪 上海亚荣生化仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 5 其他小型仪器：量筒（ 5ml、 50ml）、球形冷凝管、电子天平 等 2.2.1 硅胶柱的简介 色谱和工业水处理领域中，无定形硅胶已得到了广泛的应用，它具有多孔的无定形结构，不产生任何 x 射线衍射 1,4。硅胶的表面存在着硅醇基团 (si-oh)和暴露的硅氧烷键(si-o-si)。硅醇基团是强吸附的极性基团，而硅氧烷键是疏水基团
15、。 硅氧烷键上的 键被d-p 作用而加强，氧原子上的孤对电子参与 作用，不能参与给体与受体间的相互作用，不能形成氢键。 scott 和 kucera 证实硅氧烷基团几乎不吸附极性溶剂分子。然而，由于硅氧烷键的疏水作用性，可以吸附某些非极性溶剂分子。对硅胶改性而言，硅醇基比硅氧烷基重要得多。硅醇基团可以孤立、成对 (双生 )和缔合 (连位 )等不同的方式存在于硅胶表面。最近研究表明，不仅两个或两个以上的缔合硅醇基团可以形成键合对，甚至成对硅醇基团也可以形成键合对。硅胶表面的结构可以通过许多方法进行测定。一般情况下，随着比表面积 的增加，硅胶表面上硅醇基团的浓度略有降低。通常硅醇含量的测定方法有同
16、位素交换法、滴定法、光谱法和烷基铝法等。 nawrock1报道了用同位素交换法测定硅胶表面的硅醇基浓度是 8.01.0mol/m2，而且这个数值常常被视为硅胶的物理化学常数。硅醇基团具有明显的酸性，测定的 pka 值是 7.1。通过对硅胶表面的结构分析，可知硅胶表面硅醇基的类型、浓度和表面分布都会影响所制备键合相的性能，而硅胶的预处理则可以改变表面硅醇类型的分布，提高表面的缔合硅醇的含量，改善硅胶表面键合相的性能 硅胶柱层析原理 硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附
17、、再解吸过程。 硅胶柱层析流动相 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸 硅胶柱层析惯用方法 1.称量。 200-300 目硅胶，称 30-70 倍于上样量；如果极难分，也可以用 100 倍量的硅胶 H。干硅胶的视密度在 0.4 左右，所以要称 40g 硅胶，用烧杯量 100 mL 也可以 。 6 2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚 /乙酸乙酯 /丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿 /醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯 /
18、丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去 1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。 3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约 1/3 体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液 球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。 4.压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至 9/10 体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。 5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入
19、一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。 6.过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度 并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子： 10 mg 上样量， 1g 硅胶 H， 0.5 mL 收一馏分； 1-2 g 上样量， 50g 硅胶（ 200-300 目）， 20-50 mL 收一馏分。 7.检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底 1-2 个数量级。 8.送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢
20、谱 1.5 ppm 左右所谓的 “ 硅胶 ” 峰 13 2.2.3 湿法 1、 柱子可以分为：加压，常压，减压 。 压力 可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一
