1、 本科 毕业设计 （ 20 届） 复合磁性纳米粒子的 SERS 标记免疫研究 所在学院 专业班级 化学工程与工艺 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 本文 主要 研究 磁性 核壳纳米粒子 （ Fe2O3Au） 的制备 及其在 SERS 标记免疫 方面的应用 。 Fe(II)和 Fe(III)盐在碱性介质中通过沉淀法制备 - Fe3O4颗粒 ， 利用盐 酸羟胺 做还原剂将 氯金酸中 Au 粒子还原到 - Fe3O4颗粒 上得到 Fe2O3Au 核壳纳米粒子溶胶 ， 采用 不同 浓度的 - Fe3O4溶液制备 Fe2O3Au 核壳纳米粒子溶胶 ，对比实验现象及结果 。利
2、用 1 次包囊的 Fe2O3Au 制备免疫 Fe2O3Au 核壳纳米粒子溶胶， 利用同样的方法将 金溶胶制备成免疫金溶胶。查阅文献，了解学习 SERS 标记免疫研究。 关键词 : 磁性核壳纳米粒子；标记免疫；表面增强拉曼光谱 (SERS) II Abstract:. This paper studies the magnetic core-shell nanoparticles（ Fe2O3Au） Preparation and immunological markers in the application of SERS. Fe (II) and Fe (III) salts in alk
3、aline medium by Preparation -Fe3O4 particles, Make use of a reducing agent hydroxylamine hydrochloride acid to Au particles of gold chloride to restore to - Fe2O3 particles by Fe2O3Au core-shell nanoparticles， different concentrations of - Fe2O3 solution preparation Fe2O3Au core-shell nanoparticles
4、sol , compared to the experimental phenomena and results. Cysts using a production of immune Fe2O3Au core-shell Fe2O3Au nanoparticles sol, using the same method to gold sol was prepared by immuno-gold sol. Literature review, study and understanding of the immune markers of SERS. Keywords: magnetic c
5、ore/shell nanoparticle; Labeled immunoassay; Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS)目 录 1 绪论 . 1 1.1 选题的背景、意义 . 1 1.2 氧化铁磁性纳米粒子 . 1 1.2.1 沉淀法 . 1 1.2.2 水热法 . 2 1.2.3 热分解法 . 2 1.2.4 盐酸羟胺还原法 . 2 1.3 表面增强拉曼光谱（ SERS）标记免疫检测 . 3 1.3.1 SERS 发展历史 . 3 1.3.2 SERS 标记免疫检测灵敏度的提高 . 3 1.4 实验设计内容 . 5 2 实验部分 . 6
6、2.1 试剂和仪器 . 6 2.1.1 化学试剂 . 6 2.1.2 生物试剂 . 6 2.1.3 常用仪器 . 6 2.1.4 检侧仪器 . 7 2.2 实验内容 . 7 2.2.1 -Fe2O3 的制备 . 7 2.2.2 Fe2O3Au 纳米粒子的合成 . 8 2.2.3 金溶胶的制备 . 8 2.2.4 金溶胶及 Fe2O3Au 溶胶的免疫组装 . 8 2.2.5 Fe2O3Au 纳米粒子用于免疫检测 18 . 9 3 结果与讨论 . 10 3.1 核壳粒子 . 10 3.1.1 核壳粒子颜色 . 10 3.1.2 UV-vis . 11 3.1.3 核壳粒子的 SEM 图 . 11
7、3.1.4 Fe2O3Au 纳米粒子的磁性表征 . 12 3.2 免疫检测 . 12 4 结论 . 14 致谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 选题的背景、意义 近年来 ， 磁性纳米颗粒的研究在各个学科领域都引起了人们的广泛兴趣，如药物的靶向传递 1,核磁共振成像 2, 分离跟催化剂中的应用 3, 数据存储 4等领域。 在已报道的各类磁性纳米粒子中 , 有关 三氧化 二 铁 (Fe2O3)纳米晶体的 SERS标记研究尤其受到重视 5-6， 铁氧化物 /金核壳磁性纳米材料主要用来进行生物分子的分离 。 表面增强拉曼光谱 (SERS)作为一种高灵敏度的表面检测方法 , 可以在分子水
8、平上鉴别吸附在金属表面的物种 , 特别是对于 Au, Ag和 Cu币族金属 , 表面增强因子可达到 106。 SERS活性基底的制备是获得高质量拉曼光谱的关键，而基底的稳定性和可重复性是实际应用中待解决的主要问题。在 SERS免疫 检测中 , 采用合理的基底制备及修饰技术来降低免疫分析的非特异背景信号同样是研究的关键。将核壳纳米粒子应用于 SERS标记免疫检测可以获得较高的检测灵敏度。对于使用 SERS方法对铁氧化物 /金核壳磁性纳米材料进行生物分子靶向分离效果的检测 , 还需要进行更深入的研究 。 1.2 氧化铁 磁性纳米粒子 磁性纳米粒子是由过渡族金属或合金的纳米颗粒镶嵌在非金属介质中所组
9、成，是一种多功能磁性材料，在磁记录材料、磁流体、催化、医药和颜料等方面具有广泛的应用，从而引起人们的广泛关注。在实际应用中，纳米颗粒的生长、团聚会使 纳米磁性颗粒的特殊性能减弱，而且一些应用要求纳米材料做成薄膜，因此磁性纳米颗粒的表面修饰就变得极为重要 7。 最近几年，通过对这些方法的不断完善，已经可以实现尺寸形貌的控制，得到高稳定性、单分散的磁性纳米颗粒。合成氧化铁磁性纳米粒子的方法主要包括：共沉淀法、热分解法、微乳液法、水热合成法。 1.2.1 沉淀法 宋丽贤 等 8将 FeCl36H2O 和 FeCl26H2O 按物质的量之比为 1.8： 1 的比例溶解于水中，然后加入适量的柠檬酸、聚乙
10、二醇分别作为配合剂和分散剂，在恒温水浴中滴加 NaOH 沉淀剂。 整个反应过程在氮气的保护下进行，并以 1 500 r/min 速度搅拌。其产物经离心分离，乙醇、碳酸氢铵和丙酮洗涤后，真空干燥得磁性纳米 Fe3O4 粉体。共沉淀法合成工艺简单，易于操作，但反应过程中影响因素比较多，2 如铁盐的类型、沉淀剂的种类及加入方式、反应终点的 pH 值、熟化处理等都有影响 。 1.2.2 水热法 Fan 等 9在高压釜中放入 1.39 g FeSO4、 1.24 gNa2S2O3、 14 mL 蒸馏水，缓慢滴加 10 mL 1.0 mol/L的 NaOH 溶液，不断搅拌，反应温度为 140 ， 12 h
11、 后冷却至室温，得到灰黑色沉淀物，经过滤、水和无水乙醇洗涤，在 70 真空干燥 4 h，得到 50 nm 准球形多面体 Fe3O4 纳米晶体。该法产率高于 90%。该法是在高温高压条件下，在水溶液或蒸气等流体中合成欲制备的氧化物，具有原料易得、粒子纯度高、分散性好、晶形好且可控及成本相对较低等优点。 1.2.3 热分解法 Sun 等 10含有 1,2-二羟基十六烷、油胺、油酸的苯基醚溶剂中热分解 Fe(acac)3，可以得到 6 nm 的Fe3O4 磁性纳米颗粒。当用二苄醚代替苯基醚作为溶剂时，可以制备出 8 nm 的 Fe3O4磁性纳米颗粒。因为二苄醚的沸点为 298 ，而苯基醚的沸点为 2
12、59 ，所以利用二苄醚热分解 Fe(acac)3的温度比较高这也说明了提高反应温度可以增大颗粒尺寸。其中 1,2-RCH(OH)CH2OH 为 1,2-二羟基十六烷；RCOOH 为油酸； RNH2 为油胺。 如下图 制备 Fe3O4 的流程图及 Fe3O4 纳米颗粒照片 1.2.4 盐酸羟胺还原法 铁氧化物 /金磁性核壳纳米粒子参照文献 11的方法制备 : 取少量的铁氧化物纳米粒子加入到等同体积的 0.01 mol/L柠檬酸钠溶液中 , 超声分散后加水至 20 mL, 在机械搅拌下 , 加入过量的 80 mmol/L盐酸羟胺溶液 , 混合均匀后 , 滴加入 2mL 质量分数为 0.11%的 H
13、AuCl4溶液进行包裹 , 反应约 1h，再加入 2mL3 质量分数为 0.11%的 HAuCl4 溶液进行包裹 , 加入 HAuCl4包裹 3次后 , 溶液逐渐变为深红色。反应结束后 , 对溶液进行磁性分离 , 去除上层清液 , 得到铁氧化物 /金磁性核壳纳米粒子。 1.3 表面增强拉曼光谱 （ SERS） 标记免疫检测 SERS 标记免疫检测是一种将 SERS 与标记免疫学相结合，利用 SERS 的高灵敏度和光谱选择性，结合 抗体抗原的特异反应作用而进行的纳米标记免疫分析技术。 1.3.1 SERS 发展历史 这项技术最早是由 Rohr 等 13于 1989年创立 ， 他们首先利用表面增强
14、共振拉曼光谱 (SERS) 来研究生物分子之间的相互亲和性 ， 将二甲基偶氮苯胺以共价键与抗甲状腺促进激素 (TSH) 抗体相连 ， 形成标记抗体 ， 以银表面固定 anti2TSH抗体作为固相抗体 ， 二者与待测液中 TSH 抗原形成夹心复合物 ， 利用夹心复合物中标记物的 SERS信号来进行免疫分析 ， 但这种固相抗体的均一性较难控制 ， 重现性较差。随着生物技术的发展 ， SERS在酶 联免疫和基因工程领域也有了较大的研究进展。 Dou和 Mirkin11等分别将 SERS标记免疫技术用于酶联免疫分析与 DNA序列识别。这些研究为以后 SERS标记免疫检测打下了坚实的理论与实验基础 ，
15、引起了世界各研究小组的广泛关注。而最具代表性的研究当属 Porter等 11于 1999年首次将 SERS标记分子和羊抗小鼠 IgG直接与金溶胶相作用形成标记免疫溶胶 ， 通过相应小鼠抗原与固定在基底上的羊抗小鼠 IgG相连 ， 进行 SERS免疫检测。采用这种标记免疫溶胶方法 ， 金纳米粒子表面产生的电磁场将直接影响相连的标记分子 ， 可产 生较强的 SERS信号 ，而 且不存在距离影响SERS信号的问题。因此无需选用特定的吸收光谱与入射光波长相匹配产生共振效应的分子 ， 拓宽了标记分子的选择范围。 目前 ， SERS标记免疫研究的热点主要集中在如何减少非特异性吸附与提高灵敏度两方面 ， 纵
16、观当前的 SERS 标记免疫领域 ， 固相基底的制备与修饰以及抗体的标记是研究的关键。制备均一性良好的固相基底是 SERS 标记免疫检测的基础 ， 采用合适的标记方法兼顾生物活性同样是提高检测性能的关键。 1.3.2 SERS 标记免疫检测灵敏度的提高 SERS作为一种免疫检测的 新方法在近年来得到了很大的发展 , 它在标记免疫研究领域无疑也是一个理想的工具 ,特别体现在它的谱带窄 , 灵敏度高的特点上。通过采用具有表面增强效应的固相基底或4 金纳米粒子 双官能团标记分子 抗体 标记颗粒进行 SERS 免疫检测充分发挥了 SERS特殊的表面增强效应。同时采用较强 SERS效应的标记分子 , 增
17、加标记分子吸附量有利于提高免疫分析的灵敏度。 采用较强 SERS效应的标记分子，增加标记分子吸附量有利于改善信号测量的精密性，提高免疫检测的灵敏度。目前用于 SERS标记免疫检测的标记分子主要有两大类，一类是苯硫酚这类单官能团标记分子，由于只有一个官能团 ，在加入标记物时必须控制加入量，使纳米粒子表面留有一定的空位与抗体相连；另一类是对巯基苯胺，对巯基苯甲酸（ MBA） 等双官能团标记分子，这些标记分子一端通过 “-SH”, “-NH”与纳米粒子表面相作用，另一端通过 “-NH2”， “-COOH”与抗体相连。采用双官能团的标记分子，无需在纳米粒子表面留出空位，则可以使标记分子达到满吸附，从而
18、通过增加纳米粒子表面所吸附标记分子的数量使 SERS信号增强。Poreter等 11采用双官能团标记分子代替单官能团标记分子提高检测灵敏度，大大增加了金纳米粒子表面吸附标记分子的 数量，使待测抗原的检测限达到了 1pg/mL。因此，在对磁性分离效果的 SERS标记免疫检测中，我们采用双官能团的分子对巯基苯甲酸（ MBA）作为标记分子，以期更达到较高的检测灵敏度 目前提高 SERS标记免疫检测灵敏度的方法主要有 ： 多官能团标记 Porter等 11采用的双官能团标记分子代替单官能团标记分子是提高检测灵敏度的方法之一 , 图 2为其标记示意图。双官能团标记分子一端通过巯基与金纳米粒子相连 , 另
19、一端与抗体相连 , 这种方法大大增加了金纳米粒子表面吸附标记分子的数量 , 提高了检测的灵敏度 , 其待测抗原的检 出限达到了 1 pg mL - 1 。 双官能团标记分子 示意图 金银核壳纳米标记 葛明等 5金银核壳纳米标记是在金银染色基础上发展起来的新兴免疫标记技术。采用 Ag核 Au壳复合纳米粒子 ， 以苯硫酚 ( TP) 为标记分子 , 发现在其表面的 SERS 增强随 Au 摩尔比例的增加呈现先增5 强后减弱的趋势 ， 其最大增强为相应银纳米粒子的 10 倍。而这较强的 SERS 增强效应是来自于表面孔洞所产生的电磁场增强 ， 将这种特殊的核壳纳米粒子应用于 SERS 标记免疫 检测
20、 ， 既可以获得较高的检测灵敏度 ， 同时金壳的存在又不会使检测的蛋白质分子失活以 MBA 为标记进行 SERS免疫检测 ， 他们发现在银壳为 3 nm 时 ， 获得了最大的 SERS增强效应。但 Au核 Ag壳复合纳米粒子的薄层银壳是否对抗体抗原的活性有较大影响还有待考证。 金银染色技术 Mirkin 等 15将 SERS 标记免疫与医学上的银染色技术相结合进行免疫识别 ， 利用银的强 SERS 效应 ， 在标记免疫金纳米粒子与固相抗体所捕获的抗原发生免疫识别后进行银染色以获得较好的 SERS活性。 1.4 实验设计内容 本课题拟对以下内 容进行研究：合成以 Fe3O4为核心，金为外壳的水溶性核 /壳纳米粒子，并测试分析磁性核壳纳米粒子的光学和磁场的性能。以不同浓度的 Fe3O4进行包裹，然后进行各种性能的表征。 以自制的磁性核壳纳米粒子为免疫检测的基底，与抗体结合成固相抗体，在此基础上组装 “固相抗体 -待测抗原 -标记免疫溶胶 ”三明治复合体系。采用标记分子对巯基苯甲酸（ MBA）标记免疫溶胶，利用表面增强拉曼光谱 (SERS) 谱峰较窄且具有较强的分辨率及高灵敏度的特点，通过对标记分子特征谱峰的判断识别所加入的抗原。
