1、毕业论文 文献综述 化学工程与工艺 层孔菌乙酸乙酯提取物的分离与纯化 一、选题的背景、意义 目前，大量的研究证实多数层孔菌属的真菌多糖有较好的生物学活性，其中对裂蹄木层孔菌的研究较多 1，它能够调节细胞免疫和体液免疫，而其抗肿瘤活性明显优于其他担子菌 2。王稳航等首次对松木层孔菌子实体多糖的抗氧化性进行了研究结果表明，多糖抗氧化效果较好，对超氧阴离子自由基的清除率达到 9 0 以上，丙二醛生成抑制率达到 65左右 3。目前国内外对松木层孔菌多糖结构的研究还未见报道 本文以发酵培养的松木层孔菌为材 料，主要研究了碱提松木层孔菌菌丝体多糖的结构特点，并初步研究多糖对离体脾细胞增殖的影响，证明其对体
2、外淋巴细胞增殖有显著作用 4。 二、相关研究的最新成果及动态 主要结果如下 :1.通过形态学 ,生理生化特征，以 ITs 序列分析 ,对实验室前期分离到的层孔菌 L8 菌株进行了鉴定，确定其为木蹄层孔菌（ GeneBank no.DQ 513402） 5。在明确菌种后，通过反复实验，构建了木蹄层孔菌 L8 的液体深层发酵培养方法 ,并优化了其发酵工艺。结果表明当发酵培养基组成为 :葡萄糖 5%,蚕蛹水解液 1%，酵母粉 0.5%， KH2PO4 0.05%， MgSO4 0.05%；发酵条件为 :温度 25 ，初始 pH 5.0，转速 100 rpm，通气量 1.0 vvm,接种体积 10%（
3、 v/v） ,发酵周期 6 天时 ,层孔菌 L8 的菌丝生物量最大 ,可达 18.111.08 g/L,是优化前的 2.3倍 6。另外从给药前后荷瘤鼠的体重变化也可以看出，层孔菌 L8 的发酵菌粉给药后 ,荷瘤鼠的体重比给药前都有所增加。以上结果表明层孔菌 L8 的发酵菌粉 ,在肿瘤治疗方面 ,具有潜在的开发价值 7。 2.采用体外人源的肿瘤细胞作为筛选模型 ,对 10余种层孔菌进行了抗肿瘤活 性评价和活性成分的分析 ,结果发现 Hispolon为一些层孔菌中共有的一个活性成分 ,并发现 Hispolon 对许多肿瘤细胞表现出剂量依赖性的生长抑制作用 ,其中对胃癌细胞 SGC-7901 的活性
4、较好，作用 72 h 后的 IC50 低于 10 g/mL8。 3.利用动态荧光可视技术，流式细胞术， Western-blot等现代肿瘤细胞学和分子药理学的技术和方法 ,深入研究了 Hispolon 诱导胃癌细胞死亡的分子机理。结果发现 Hispolon 可以诱导胃癌细胞发生一种特殊的 ROS介导的线粒体途径的凋亡。该凋亡机制如下所述 :Hispolon 通过将细胞内的 GSH驱逐出细胞外 ,使得细胞内的 GSH 含量下降 ;同时抑制细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶 GPX 的活性 ,使得胃癌细胞的抗氧化能力大大下降 ,从而导致 ROS 的急剧增加 9。大量的 ROS积聚引起了线粒体膜的氧化损伤，
5、破坏了线粒体膜的完整性，导致线粒体膜的通透性增加，使得线粒体中的细胞色素 C 大量释放出来，激活了 Caspase 的级联反应 ,启动凋亡程序 ,最终引发细胞发生凋亡。相比之下 ,当Hispolon作用正常的胃粘膜上皮细胞后 ,ROS并没有显著增加 ,细胞也没有发生明显的死亡。探索造成这种差异的原因时 ,我们发现胃癌细胞本身固有的 ROS水平比正常的胃上皮细胞要高 ,这使得胃癌细胞对 Hispolon 更加敏感。 104.低剂量的Hispolon（ 2.5g/mL）可以显著地增加化疗药物（丝裂霉素 C,5-氟尿嘧啶 ,阿霉素）对胃癌细胞 SGC-7901 的杀伤性。并且这种增敏机制是通过引发胃
6、癌细胞中的GSH 急剧下降 ,导致了 ROS 的大量积聚 ,进而引发了细胞死亡。综上所述 ,本论文的研究结果为解决层孔菌类药用真菌的人工资源化问题 ,深入研究其活性成分的作用机制提供了一种思路和方法 ,并为层孔菌类药用真菌的新药创制提供了一定的依 据 11。 三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 1 经水提的菌丝体残渣，烘箱干燥，称取 5克干燥的松木层孔菌菌丝体， 然后加入 0.5 mo1/LNaOH 溶液，在一定温度下进行一定时间的提取，反复提取 3次，合并提取液经过过滤加 HCl 中和，在水浴锅中浓缩至小体积，得浓缩液，透析，用 3 倍体积 97 ( 质量
7、分数 ) 乙醇醇析得水溶性粗多糖沉淀，低速离心机离心，转 3500 , 离心 10分钟，弃去上清液，沉淀用无水乙醚洗涤 2次 ，真空干燥后，得碱提水溶性粗多糖的产品 12。 2 称取 20.0 g沙棘籽粕 9份，分成 3组 ,每组 3份，按 1:10的料液比分别入水、70 乙醇和 70丙酮， 30 下搅拌提取 2 h。丙酮提取的得率最高，为 1 35 ，而乙醇和水提取的得率基本相近，为 1 00 和 0 91 。丙酮的提取效果最佳，这一点与相关文献报道相符 I9 J。但是丙酮挥发性较强，在提取和浓缩时很容易损失，并且可能带来环境污染和产品有毒有机物残留。在保证一定得率的同时还要考虑成本和操作的
8、难易程度，以及工业化生产实际需要，因此乙醇和水提取是可行的。从成本上考虑，水的成本最低并且使用 方便，故本试验采用水作为提取剂进行后续试验 13。 3.1.1 对照品溶液的制备取荷叶碱对照品适量，精密称定，用三氯甲烷配制成浓度为 0 0154 mg/mL 的荷叶碱对照品溶液。 3.1.2 溴甲酚绿缓冲液的制备 精密称取溴甲酚绿 125 mg，用 0.2 mol/LNaOH 12.5 mL溶解，加入适量邻苯二甲酸氢钾，加少量水溶解，调 pH 4.0。 3.1.3 标准曲线的绘制 分别精密吸取 0， 0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5 mL对照品溶液于 5 mL量瓶中，加三氯甲烷至刻度
9、，振摇，移至分液漏斗 中，精密加入溴甲酚绿缓冲液和 0.2 mol/L NaOH各 0.5 mL，摇匀，静置，取澄清的三氯甲烷层在415 nm波长下测定紫外吸光度，以荷叶碱浓度为纵坐标，吸光度为 横坐标，得回归方程 Y=71.510 9X一 0.014 76， r=0.998 614。 四、论文详细工作进度和安排 2010.11 完成选题，老师布置任务 2010.12 查阅文献，翻译外文文献 2011.1 完成文献综述和开题报告 2011.3 2011.4 毕业论文实验工作 2011.5 2011.6 数据处理，撰写毕业论文 ，毕业论文的答辩 五、主要参考文献 1 庄鑫 ,周舒扬等 .基于核苷
10、酸序列及 RNA二级结构基础的针层孔菌属 (Phellinus)复合种分类学研究 J .中国农学通报 .2010.（ 17）： 35-38 2 袁雷 ,钟国辉 ,田发益 .松木层孔菌胞外多糖的组成分析及免疫学活性研究 J. 中国现代应用药学 .2010-08-014: 74-77. 3 陈义勇等 . 桦褐孔菌多糖 IOP3a 的分离纯化及其体外抗肿瘤活性研究 J. 食品科学 . 2010-15-022: 58-62 4 M. Turan, U. Mart, B. Yksel, M. S. elik, Chemosphere, 2005, 60, 1487： 61-63 5 B. N. K. N
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