1、安徽工程大学生物化学工程学院 毕业论文 高产 -氨基丁酸乳酸菌的等离子诱变选育 摘 要 -氨基丁酸（ -amino butyric acid，简称 GABA )是广泛分布于自然界的一种非蛋白质氨基酸，具有镇痛、促进生长激素分泌及预防老年痴呆等生理功能。 为提高 GABA 产量 ， 本实验应用常温室压等离子体（ Atmospheric and Room Temperature Plasma， 简称 ARTP ）对实验室已有菌株 HX-3-6 进行诱变，挑选致死率达到 90%以上的菌株进行发酵验证，并通过梯度平板按 GABA 浓度的高低以及菌落的大小进行初筛， 再利用发酵培养基进行复筛并进行遗传稳
2、定性试验。 获得的稳定突变株 L-120-1且产量达到 5.828g/L，较诱变前产量（ 4.904）提高 18.84%。以突变株 L-120-1为出发菌株进行 ARTP 诱变，得的稳定突变株 90s-高 2产量达到6.178g/L，较诱变前产量 (5.319g/L)提高 16.15%。 最终得到稳定高产 GABA的乳酸菌突变菌株 90s-高 2产 GABA比诱变前 的 HX-3-6菌株产量提高 25.98%。 关键词 ：乳酸菌； GABA； ARTP；发酵；遗传稳定 Lactic acid yield -amino butyric acid plasma Breeding ABSTRACT
3、-amino butyric acid ( -amino butyric acid,abbreviated GABA) is a non-protein amino acids are widely distributed in nature,it has analgesic and to promote growth hormone secretion and prevention of Alzheimers and other physiological function. To improve the production of GABA,the Atmospheric and Room
4、 Temperature Plasma(ARTP) was used to mutagenesis HX-3-6 (the strain keep in the experiment),and then mutations was used for future fermentation whose fatality rate were above 90%, the gradient plate with GABA and the size of the colony were used for the first screening,and then fermentation medium
5、was used for the next screening to test the genetic stability of mutant strains of lactic acid bacteria .Obtained stable mutants L-120-1 and the yield reached 5.828 g/L,than the pre-mutagenic production (4.904g/L) improved 18.84%,and then the L-120-1 was mutagenesis, a stable mutants 90s-high 2 was
6、got and production reached 6.178g/L,compared with before mutagenesis production increase in 6%.Finally the high production mutant 90s-2 compared to the strain of HX-3-6 improved 25.98% . Keyword: Lactobacillus;GABA ;Ferment ;Genetic stability 安徽工程大学生物化学工程学院 毕业论文 插图清单 图 2-1 GABA的酶标仪标准曲线 12 图 3-1 HX-3
7、-6的生长曲线 13 图 3-2 HX-3-6的诱变致死率曲线图 14 图 3-3 HX-3-6诱变后 GABA的产量 15 图 3-4 L-120-1的生长曲线和 Ph值曲线 16 图 3-5 L-120-1的诱变致死率曲线 17 图 3-6 L-120-1诱变后菌株的 GABA产量和 OD值的曲线 18 表格清单 表 1-1实验药品（试剂） 6 表 1-2试验仪器 7 表 4-1 乳酸菌 HX-3-6 所测 OD600值 22 表 4-2 乳酸菌 HX-3-6诱变致死率 22 表 4-3 乳酸菌 HX-3-6诱变后 GABA的产量 22 表 4-4 乳酸菌 L-120-1所测的 OD600
8、 和 pH 值 23 表 4-5 乳酸菌 L-120-1诱变致死率 23 表 4-6 乳酸菌 L-120-1诱变后 GABA产量 23 安徽工程大学生物化学工程学院 毕业论文 引言 -氨基丁酸 ( -amino butyric acid， GABA)是一种广泛分布于动植物体内的非蛋白氨基酸，具有许多重要的生理功能。在植物中， -氨基丁酸 (GABA)参与了植物抵御逆境胁迫反应，对病虫害的保卫反应等过程。在动物中， GABA作为哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，参与脑循环生理活动，具有降低血压、治疗癫病、镇静安神、促进睡眠、增强记忆力、控制哮喘、调节激素分泌、促进生殖、肾肝功能活化等
9、功能，被广泛的应用于食品、医药等工业。因此 对其作用机理、制备研究己经成为一个热点。目前主要通过大肠杆菌发酵生产 GABA，但大肠杆菌存在着安全卫生方面的极大隐患。因此通过诱变的方法获得高产 GABA的安全性新型菌种具有重要的意义 13。 在食品和医药工业中，利用公认的安全性益生菌 乳酸菌进行发酵生产GABA具有更广泛的前景，目前工业生产的 GABA产量较低 4， 5，故为提高 GABA产量本实验采用等离子诱变乳酸菌育种选育 紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起 DNA结构的改变而形成突变型 6。但是紫外诱变育具有育种过程繁 重，诱变效果差等问题。 化学诱变是通过采
10、用一些分子结构不太稳定的化学诱变剂进行的，它通过化学试剂造成生物的损伤和错误修复，产生突变体 7。但是化学诱变育种过程复杂以及具有对人体危害比较大的操作环境。 本实验采用一种新型微生物诱变育种方法 -常压室温等离子体（ ARTP)诱变育种系统。 ARTP是近几年来发展起来的一种等离子体源，能够在大气压下产生温度在 25-40 之间的、具有高活性粒子浓度的等离子体射流 ，等离子体具有气温低、电子温度高的非平衡特性以及活性离子浓度高的特点。据科学研究表明，等离子体中的活性粒子作 用于微生物，能够使微生物细胞壁 /膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导
11、致微生物产生突变 8。 ARTP 诱变育种系统具有操作安全、过程简单、突变率高、经济环保等优点；所以本实验利用 ARTP对产 GABA的乳酸菌进行诱变育种将诱变后的突变菌株用含有代谢产物 GABA 的培养基进行抗性初筛，再利用发酵培养基进行复筛进行遗传稳定性试验，最终得到稳定高产 GABA的乳酸菌突变菌株。 第一章 绪论 1.1 -氨基丁酸的研究现状 GABA 在食品中的研究和应用始于上世纪八十年代中期，应用产品以日本茶饮料 Gabaron为代表。用 Gabaron茶饮料饲喂患 原发性高血压 的小白鼠，数周内发现其血压由 175-180mmHg 降低至 150mmHg，同时并未发现小白鼠的其它
12、任何生理异常现象 9。 1994年， Takayo等在研究用水浸泡的米胚芽的氨基酸分布时，发现经过发酵处理的米胚芽中 GABA的积累量很高，达到 200-300mg/100g10。 1996年，富含 GABA 的米胚芽制品在日本实现了商业化。神经生理及神经医学的研究表明 GABA是一种重要的活性物质，在人脑中，虽然 GABA 可由脑部的谷氨酸在专一性较强的谷氨酸脱羧酶 作用下转化而成，但是年龄的增长和精神压力的加大使 GABA 的积累异常困难，而通过日常饮食补充可有效改善这种状况，从而促进人体健康 11。 最近，日本科学家利用米胚芽等原料开发制造的富含 GABA 的 功能食品配料 ，已经广泛地
13、应用于饮料、果酱、糕点、饼干、调味料等制品中。现在还有报道，应用生物技术制造的高浓度 GABA饮料以及利用乳酸菌等制作的富 含 GABA的食品配料，均可直接作为或者用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。我国有关GABA食品的研究开发报道极少，这方面的研究开发尚属于起步阶段。 1.2 常压室温等离子诱变系统 1.2.1 ARTP生物育种基本原理 常压低温等离子体是近几年才开始研究的一种新型等离子体源，具有气体温度低、活性粒子浓度高、能量高、操作简便等优点。基础实验研究表明，常压低温等离子体中的高浓度活性粒子能够作用于微生物的遗传物质，使其在短时间内产生致畸突变，是一种效果良好的诱变源 12
14、。相比传统的物理诱变方法（如离子束注 入、放射线诱变）和化学诱变方法，常压低温等离子体诱变方法具有操作安全、简便、对人体无任何副作用、对环境无污染等特点。 1.2.2 ARTP的发展优势 常规的诱变育种方法有化学诱变育种和物理诱变育种。 微生物的诱变育种，主要是以人工诱变的手段来诱发微生物基因突变，从而改变遗传结构和功能，再通过筛选，从很多的变异菌体中筛选出所需的产量高、性状优良的突变株，并且找出最佳培养基及最佳培养条件，使其能在最适环境条件下合成所需产物。 清华大学等离子体健康科技研究组（工程物理系）、环境生物技术实验室（化学工程系）联合北 京思清源生物科技有限公司，采用国际先进的常压低温等
15、离子体产生技术，结合近几年的最新研究成果与自动控制方法，联合研制出第二代 ARTP生物育种机。该育种机具有工作稳定、无需预热、操作简便、人机交互性能好等优点，能够在工业环境下产生常压低温等离子体使菌种产生诱变，加快诱变育种进程，提高工业生产效率 13。 ARTP 诱变的研究能够促进等离子体与生物科学的融合和交叉，一方面推动具有多参数、高通量、可控性更强的多通道的常压低温等离子体技术装备的发展与创安徽工程大学生物化学工程学院 毕业论文 新，另一方面，通过对不同生物分子及物种的调控与作用方法研究，形成了 等离子体生物技术（ Plasma biotechnology）的新研究领域 -生命科学。 1.
16、3 立题依据与意义 -氨基丁酸 ( -amino butyric acid， GABA)是一种非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢的一种抑制性递质， GABA 具有降血压、增强记忆力、活化肾功能、改善肝功能、防治肥胖、营养神经细胞等作用等诸多功能 14，研究通过微生物发酵法获得 GABA具有重要意义。 随着 GABA的生理功能特性逐渐被人类认识，利用 GABA的富集技术开发富含GABA的保健食品必将是一个很有潜力的研究领域，化学合成 GABA 安全性较差，植物富集 GABA含量不高，利用生物合成法中的微生物 (乳酸菌 )发酵生产 GABA显示了广阔的开发前景 15。但是乳酸菌发酵产 GABA的工业产
17、量不高。 鉴于紫外诱变育种具有育种过程繁重，诱变效果差等问题；化学诱变育种过程复杂以及具有对人体危害比较大的操作环境。 本实验利用新型诱变技术（常压室温等离子体诱变育种系统）对乳酸菌进行诱变育种，从而得到高产 GABA的乳酸菌菌种。 1.4 本课题主要研究的内容 （ 1)本实验对实验室已筛选出的产 -氨基丁酸的乳酸菌进行常温室压等离子体诱变，并使用 梯度平板对诱变株进行初步筛选。 (2)对大量突变株进行发酵培养复筛，以期获得生长速率快，高产 -氨基丁酸的乳酸菌。 第 2 章 实验材料 2.1 菌种来源 由安徽芜湖安徽工程大学生物技术实验室保藏，编号为 HX-3-6。 2.2 实验药品 表 1-
18、1-实验药品（试剂） 药品名称 药品类型 生产厂家 琼脂 生化试剂 国药集团化学试剂有限公司 葡萄糖 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 酵母提取物 生化试剂 国药集团化学试剂有限公司 胰蛋白胨 生化试剂 国药集团化学试剂有限公司 鱼粉蛋白胨 生化试剂 国药集团化学试剂有限公司 吐温 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 NaCl 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 MgSO4 生化试剂 上海试剂四厂 硫酸锰 生化试剂 蚌埠化学试剂厂 95%乙醇 分析纯 国药集团化学试剂总厂 乙酸钠 分析纯 蚌埠化学试剂厂 磷酸氢二钠 分析纯 蚌埠化学试剂厂 丁二酸钠 分析纯 生工生物上海有限公司 柠檬酸三胺 分析纯
19、 国药集团化学试剂总厂 谷氨酸钠 分析纯 南京吉瑞化学试剂有限公司 氢氧化钠 分析纯 国药集团化学试剂总厂 GaCO3 化学试剂 蚌埠化学试剂厂 苯酚 分析纯 国药集团化学试剂总厂 安徽工程大学毕业论文 2.3 实验仪器 表 1-2-试验仪器 实验仪器 生产厂家 SPX 250BS 生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司 ARTP 诱变育种系统 - 北京思清源物科技有限公司 全自动酶标仪 Multiskan Fc 塞默非世尔仪器有限公司 美菱 BCD-181KC 冰箱 美菱电器有限公司 全自动高压灭菌锅 HVE-50 华夏行仪器有限公司 SW-CJ-CO 型净化工作台 苏州净化设备有限公司
20、DHG 9143BS 电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司 LDZX 50KBS 立式电热压力蒸汽灭菌锅 金坛市荣华仪器制造有限公司 恒温水浴锅 HH-2 金坛市杰瑞尔电器有限公司 SK 1 快速混匀器 金坛市杰瑞尔电器有限公司 FC104 电子天平 上海精密科学仪器有限公司 PHSJ 3F 型实验室 pH 计 常州国华电器有限公司 100l 精密微量移液器 GilsonSAS.France 1000l 精密微量移液器 GilsonSAS.France 5000ul 精密微量移液器 GilsonSAS.France 80-2 离心机 江苏金檀市荣华仪器制造有限公司 15W 紫外灯
21、苏州净化设备有限公司 实验室 pH 计 PHSJ-3F 上海精密科学仪器有限公司 电炉 丹阳市飞和五金电器厂 可见分光光度计 722 上海佑科仪器仪表有限公司 磁力搅拌器 SK-1 金坛市杰瑞尔电器有限公司 美的电冰箱 BCD 195TC 合肥荣氏达冰箱有限公司 高通量恒温振荡器 Canvic HTS-T008 上海世平实验设备有限公司 不锈钢蒸馏水器 上海生银医疗仪器仪表有限公司 本试验还需用品： Eppendorf 离心管、烧杯、玻璃棒、镊子、试剂瓶、量筒、洗瓶、石棉网、锥形瓶、培养皿、剪刀、白铁锅、酒精灯、试管架、冰袋、试剂勺、涂布棒、甘油管等。 2.4 培养基及相关试剂的配制 （ 1）
22、 MRS 液体培养基：鱼粉蛋白胨 10g 酵母提取物 10g 葡萄糖 5g 乙酸钠 5g 磷酸氢二钾 0.2g 柠檬酸三胺 0.2g 硫酸镁 0.2g 硫酸锰 0.05g 吐温 -80 0.1mol/L 水 1000mL pH6.5 115 灭菌 25分钟 （ 2） MRS 固体培养基：鱼粉蛋白胨 10g 酵母提取物 10g 葡萄糖 5g 乙酸钠 5g 磷酸氢二钾 0.2g 柠檬酸三胺 0.2g 硫酸镁 0.2g 硫酸锰 0.05g 琼脂 20 25g 水 1000mL pH6.5 115 灭菌 25分钟 （ 3）含 GABA 的 MRS 固体培养基：鱼粉蛋白胨 10g 酵母提取物 10g 葡
23、萄糖 5g 乙酸钠 5g 磷酸氢二钾 0.2g 柠檬酸三胺 0.2g 硫酸镁 0.2g 硫酸锰 0.05g 琼脂 20 25g GABA 60g 水 1000mL pH6.5 115 灭菌 25分钟 （ 4）发酵培养基：酵母提取物 5g 胰蛋白胨 5g 葡萄糖 10g 丁二酸钠5g 1%的谷氨酸钠 水 1000mL pH6.5 115 灭菌 25分钟 （ 5）生理盐水溶液： 1.8gNaCl 溶于 200mL蒸馏水。 115 灭菌 25min。 （ 6）硼酸缓冲液 1.525g硼砂和 0.247g硼酸溶解后定容至 100mL。 (3)谷氨酸钠溶液： 0.1g 的谷氨酸钠加入 100mL 的无菌水中，配制用于对高产 -氨基丁酸乳酸菌的等离子诱变选育 照的谷氨酸钠溶液。 第 3 章 实验方法 3.1 对乳酸菌 HX-3-6进行 ARTP诱变育种 3.1.1 乳酸菌 HX-3-6生长曲线的测定 （ 1）菌种的活化：将标准储备菌株取出，并恢复至室温后，按 10%（ v/v）接种量接种 1mL 乳酸菌于装有 9mL 的 MRS 液体种子培养基的 50mL 三角瓶中，
