1、SRY基因的检测,目的要求掌握PCR反应的基本原理掌握性别决定的分子机制掌握用PCR扩增检测性别的方法掌握用PCR扩增检测性别方法的应用,原理,1聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的基本原理是，通过热变性使目的DNA（模板DNA）双链解开；通过退火将引物复性结合到它们的互补位置；通过DNA聚合酶延长引物，反复循环体外扩增出大量一对引物之间的DNA片段。,聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction（PCR）,一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术,PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大百万倍,染色体,Mull
2、is (1993),PCR基本工作原理,以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板3和5端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制延模板链延伸直至完成新的DNA合成。重复这一过程，可使目的DNA片段得以扩增。,PCR体系基本组成成分,含Mg2+的缓冲液,dNTPs,耐热DNA聚合酶Tag DNA聚合酶,特异性引物一对分别与待扩增DNA序列两端互补的寡核苷酸片段。,模板DNA,PCR基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,循环25-30次,使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除,使引物和模板DNA退火结合,此温度下
3、DNA聚合酶以dNTP 为底物催化DNA链的延长,三个步骤为一个循环，每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环,第一轮循环,引物A,引物B,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,DNA-Pol,DNA-Pol,温度,第二轮循环,引物A,引物B,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,温度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第三次循环,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,温度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第一次循环,第二次循环,第三次循环,第四次循环,PC
4、R的主要用途,PCR的用途,基因突变分析,基因的体外突变,目的基因的克隆,DNA序列测定,DNA和RNA的微量分析,1、与反转录结合，直接从组织细胞中的mRNA 获得目的基因；2、利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得目的基因片段；3、利用简并引物从cDNA 文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段；4、利用随机引物从cDNA文库中克隆基因。,利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的DNA的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,PCR技术高度敏感，对DNA的含量要求很低。理论上只要存在一分子的模板就可以获得目的片段。RNA需要反转录。,利用PCR结合其它技术，可以提高基
5、因突变检测的敏感性。,原理,2 人类个体的表型性别是由Y染色体决定的,具体地说是由Y染色体上编码睾丸发育的睾丸决定因子(testis determining factor,TDF)基因所决定，TDF基因的存在决定着睾丸的发育，即决定个体发育为男性。研究表明TDF基因位于Y染色体短臂与拟常染色体相接的35kb区域，该区域又称为Y染色体性别决定区（sex determining region of the Y，SRY）。 。,3 在SRY基因区域设计特异的引物，如果能够利用PCR技术体外扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性。本实验在SRY基因区域内设计了一对引物，利用引物Y1.5/ Y
6、1.6扩增出一239bp的片段。4 利用PCR技术扩增SRY基因片段检测性别具有广泛的实际应用价值，如结合细胞遗传学的核型分析，通过确认SRY所在区域的缺失或易位，诊断46，XY女性或46，XX男性性反转综合征的患者；通过检测胎儿的性别，预防甲型血友病、G6PD缺乏症等X连锁隐性遗传病患儿的出生；,5 通过骨髓移植后Y染色体特异的SRY基因片段的DNA分析是由阳性转为阴性或相反，来判断异性别的骨髓移植程度；多年尸块的DNA常有降解，而PCR只分析DNA的一小部分，不受降解的影响，因此本实验技术常应用于法医学上尸块或血斑的性别确定；此外，本实验还可用于需要快速、准确、同时需检查大量标本的运动员体
7、检。,一、由微量外周血标本制备模板DNA 试剂与材料： 1、 细胞裂解缓冲液 （SDS ；蛋白酶K ）2、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体积比） 3、3mol醋酸钠（PH5.2） 4、无水乙醇，-20保存 5、70%乙醇，-20保存 6、TE缓冲液,步骤,1、1.5ml Eppendorf离心管中加入细胞裂解液100l。2、取末梢血一滴（约5-10l）立即悬浮细胞裂解液中，37保温2小时。3、加入100l酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体积比）混合液，盖紧。轻轻摇混，充分混合；室温15000rpm离心5分钟。4、用开口粗的吸管转移上层水相于新的Eppendorf离心管，按步骤5重复抽提1次。
8、如果水相还混浊，增加一次酚抽提。,步骤,5、转移上层水相，加入10l 3mol醋酸钠（PH5.2）轻摇混匀，再加入250l冷无水乙醇沉淀DNA。室温放置10分钟。6、415000rpm离心15分钟，使DNA沉淀（颗粒化）。7、弃上清，加70%冷乙醇500l轻振混匀，415000rpm离心5分钟。8、弃上清，将Ep管倒置在纸巾上，完全除去水分。将DNA自然干燥。9、加10l TE溶解，制成DNA样品。（进行PCR时，取1l即可）。,二、PCR检测性别 试剂与材料：1、 上、下游引物 （各5 mol/L）2、 模板DNA溶液3、 10PCR缓冲液：（高压灭菌）4、 dNTPs溶液（2.5mmol/
9、L原液）5、 Taq DNA聚合酶（5U/l）6、 液体石蜡（高压灭菌）,琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 7、电泳级琼脂糖8、电泳缓冲液：5TBE贮存液 9、5mg/ml的溴化乙锭溶液，4暗存。10、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油于水中。4贮存。11、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶模和加样孔梳齿。12、透射紫外灯、照相机和胶带纸。,实验步骤： （一）、SRY基因引物设计 Y1.5 5-CTA GAC CGC AGA GGC GCC AT- 3 Y1.6 5-TAG TAC CCA CGC CTG CTC CGG- 3 扩增DNA片段长度239bp,（二）、PCR反
10、应 1、 在0.5ml Eppendorf管中依次加入H2O 60.5l10PCR缓冲液 10ldNTPs溶液（2.5mmol/L原液） 8l（0.2mmol/L）上游引物 （5 mol/L） 10l （0.5mol/L）下游引物 （5 mol/L） 10l（0.5mol/L）模板DNA溶液（基因组DNA溶液） 1l Taq DNA聚合酶（5U/l） 0.5l（2.5U/100l） 总量 100l,2、 混匀，短暂离心。3、 PCR条件Y1.5/ Y1.6PCR扩增条件：变性 955分钟 变性 9475秒 复性 5590秒 延伸 72150秒循环30次。扩增产物冷却至室温可于4保存。,（三）、扩增产物分析（方法参见实验四、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段） 1、组装制胶模。2、参照琼脂糖凝胶的分离能力表选择凝胶浓度（一般为0.8%），称取琼脂糖，用电泳缓冲液在沸水浴上或微波炉上将琼脂糖颗粒完全溶解。,3、待胶冷却至50左右，加入溴化乙锭（终浓度为0.5g/ml，每10ml加入1l原液），充分混匀后倒入胶模。 4、向DNA酶解管中加入1/10体积的上样缓冲液，充分混合。用微量移液器将样品依次加入加样孔内。,5、电泳。6、电泳完成后可直接在透射紫外灯下观察结果。,
