1、天然药物化学实验,一、黄柏中生物碱的提取、分离和鉴别二、槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别 三、大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别 四、穿心莲中穿心莲内酯的提取、分离与鉴别五、八角茴香挥发油的提取及鉴别,实验一 黄柏中生物碱的提取、分离和鉴定,目的要求,掌握从黄柏中提取小檗碱的原理和方法。掌握柱色谱的基本操作以及在中药有效成分提取分离中的应用。掌握小檗碱的理化性质和鉴别方法,黄柏简介,芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid及黄檗Phellodendron amurense Rupr的干燥树皮，前者习称“川黄柏”，后者习称“关黄柏”。性能：苦，寒。功效：清热
2、燥湿、泻火解毒、退虚热。应用：湿热泻痢、黄疽、带下、热淋、脚气、骨蒸劳热、盗汗、遗精、疮疡肿毒、湿疹骚痒；盐黄柏滋阴降火，用于阴虚火旺，盗汗骨蒸。,黄柏中主要化学成分简介,小檗碱(berberine)，含量为1.4%-4%(川黄柏含量较高) 性状：黄色结晶，有5.5个结晶水，mp.145溶解性：能缓缓溶于冷水中（120）微溶于冷乙醇（1100）易溶于热水和熱乙醇微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮硝酸盐极难溶于水盐酸盐微溶于冷水（1:500）但较易溶于沸水硫酸盐和枸橼酸盐在水中溶解度较大（1 30）盐酸小檗碱为黄色结晶，含2分子结晶水，220时分解并转变为棕红色小檗红碱，285时完全熔融,药根碱 盐酸盐
3、为黄色结晶，mp.206，在冷水中溶解 度比盐酸小檗碱大，易溶于热水和乙醇。巴马丁 盐酸盐为黄色针晶，mp.241，在冷水中溶解 度比盐酸小檗碱大，易溶于热水和乙醇。,生物碱碱性强弱与提取分离的关系,碱性是生物碱最重要的化学性质，也是提取、分离和结构鉴定的理论依据 生物碱的碱性大小与pKa的关系：pKa2为极弱碱，pKa27为弱碱，pKa711为中强碱，pKa11以上为强碱 生物碱分子中碱性基团的pKa值大小顺序一般是：胍基季铵碱N-烷杂环脂肪胺芳香胺N-芳杂环酰胺吡咯,一般来说双键和羟基的吸电诱导效应使生物碱的碱性减小。但具有氮杂缩醛结构的生物碱常易于质子化而显强碱性。,粘液质的基本性质及对
4、提取分离的影响,定义：与树胶结构相似的多糖类物质 ，多存于植物薄壁组织的粘液细胞内基本性质：干燥粘液质为白色粉末，有强烈的吸湿性，在水中能迅速膨胀，溶解形成粘稠的胶浆，不溶于有机溶剂。分子中含有酸性基团游离的羧基。在提取中药其他成分时，少量粘液质的存在使其水提取液粘稠性较大而极难过滤稀醇沉淀或加入石灰水形成钙盐沉淀,小檗碱提取分离的基本原理,小檗碱为季铵碱，其游离型在水中溶解度较大，其盐酸盐在水中溶解度较小。利用小檗碱的溶解性及黄柏中含黏液质的特点，首先用石灰乳沉淀黏液质，用碱水提出小檗碱，再加盐酸使其转化为盐酸小檗碱沉淀析出。,提取,黄柏粗粉200g 加入0.5 %硫酸溶液1000ml，浸泡
5、24h， 双层纱布滤过 滤液 药渣,分离,滤液 加入石灰乳调pH12左右 静置，抽滤 沉淀 滤液 加浓HCI调pH2左右，加入总体积10%的食盐 静置24h，抽滤 盐酸小檗碱粗品 母液,鉴别,生物碱的一般鉴别反应 取少量精制盐酸小檗碱，用稀硫酸溶解，分成4份，分别滴加以下试剂，观察有无沉淀析出及颜色变化，记录所观察到的现象和反应结果，并根据现象得出结论。碘化铋钾( Dragendorff )试剂 碘化汞钾( Mayer )试剂 碘化碘钾( Wagner )试剂 硅钨酸( Bertrand )试剂,鉴别,特殊鉴别反应取盐酸小檗碱少量，加稀盐酸2ml溶解后，加漂白粉（或次氯酸钠）少许，振摇后观察颜
6、色变化。取盐酸小檗碱50-100mg，溶于50ml热水中，加入10%氢氧化钠2ml，混合均匀后，于水浴中加热至50，加热丙酮5ml，放置，观察有无沉淀析出及颜色变化。,鉴别,薄层色谱鉴别样品：自制盐酸小檗碱甲醇溶液（约1mg/ml）。 盐酸小檗碱对照品甲醇溶液（约1mg/ml）。吸附剂：硅胶GCMC板，湿法铺板，105活化30min。展开剂：正丁醇冰醋酸水(712，上层) 甲醇丙酮醋酸(451) 醋酸乙酯异丙醇甲醇浓氨试液 (631.51.5)显色剂：改良碘化铋钾试剂。展开后先观察荧光（365nm，亮黄色）斑点，再喷显色剂，显橙色。,实验二槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别,目的要求,1.了
7、解炮制对芦丁含量的影响。2.掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。3.掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。,槐米简介,槐米为豆科植物槐Sophora japonica L的干燥花蕾。主产于河北、山东、河南、陕西、江苏、广东、广西、辽宁等地。以河北、山东、河南产量大。 性能：苦，性微寒。 功效：凉血止血、清肝泻火 应用：用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等。,槐米主要化学成分简介,主要含有芦丁、槲皮素，还含少量皂苷类及多糖、粘液质等。槐米含芦丁可高达20%，槐花开放后降至13%。芦丁可用于治疗毛细血管脆性引起的出血症，并用作高血压辅助治疗剂。芦丁还可以作为制备槲皮素、羟乙
8、基槲皮素、羟乙基芦丁、二乙胺基乙基芦丁等的原料。,芦丁为浅黄色粉末或极细微淡黄色针状结晶，含3分子结晶水（C27H30O163H2O），加热至185以上熔融并开始分解。 芦丁的溶解度，在冷水中1:10000，沸水中1:200，沸乙醇中1:60，沸甲醇中1:7，可溶于乙醇、吡啶、甲酰胺、甘油、丙酮、冰醋酸、乙酸乙酯中，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚。 芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又可析出。,提取（1）,槐米粉末 取约6倍量水，煮沸，放入槐米及硼 砂适量微沸2030分钟，随时补充失 去的水份，趁热抽滤，药渣加4倍量 水，同法再提1次 合并提取液,分离,合并提取液 用盐酸调
9、pH45，搅匀， 静置，抽滤，水洗至洗液呈中性，60干燥。 芦丁粗品,提取（2）,槐米粉末 加约6倍量水及硼砂适量，煮沸，在搅 拌下缓缓加入石灰乳至pH89。 在保持该pH条件下，微沸2030分钟，随 时补充失去的水份，趁热抽滤，药渣加 4倍量水，同法再提2次 合并提取液,分离,合并提取液 在6070下用浓盐酸调pH5，搅匀， 静置，抽滤，水洗至洗液呈中性，60干燥。 芦丁粗品,苷的水解，苷元和糖的分离 芦丁1g 置150ml圆底烧瓶中，加2H2SO480ml，加热微沸1h 水解 (注意观察有何现象，为什么?)，放冷后抽滤 滤液 沉淀 (保留作糖的鉴别) 水洗至中性， 用乙醇水（1：1）30m
10、l混合溶剂重结晶： 加热溶解，趁热抽滤，放置析晶，抽干，干燥 ， 苷元(槲皮素),鉴别,糖的纸色谱鉴定 滤去槲皮素后的水解母液，取出20 ml，加碳酸钡细粉中和，中和时不断搅拌，至溶液呈中性，滤去白色硫酸钡沉淀。滤液浓缩至2.3ml，作纸色谱的供试品溶液，与已知糖液作对照，可得到和葡萄糖、鼠李糖相同Rf值的斑点，有时尚能呈现芸香糖的斑点。 样品：苷水解后的糖样品液。 对照品：葡萄糖对照品水溶液。鼠李糖对照品水溶液。 支持剂：新华牌一号滤纸(长度15cm，宽度按需要决定)。 展开剂：正丁醇醋酸水(4：1：5，上层)。 显色剂：苯胺邻苯二甲酸试剂。喷雾后于105烘10min显色(显棕色或棕红色斑点
11、)。,鉴别,黄酮苷的一般鉴别方法 Molish反应：取芦丁少量于试管，加乙醇0.5ml溶解，加1%萘酚溶液数滴，沿管壁滴加浓硫酸0.5ml，观察两液面处有何现象。 Fehlings反应：取芦丁少许溶于热水中，加斐林试剂lml，沸水浴上加热后，观察有何现象? 如无砖红色沉淀产生则加入盐酸，使呈酸性，水浴上加热30min，观察有无沉淀，如有，过滤除去，滤液加氢氧化钠溶液调至弱碱性，再加斐林试剂检查。 盐酸镁粉反应：取芦丁少许，加稀醇热溶，加镁粉少许，滴加浓盐酸数滴，观察颜色氯化铁反应：取芦丁少许，溶于水或乙醇中，加1%三氯化铁醇溶液1滴，观察颜色变化。 三氯化铝反应：取芦丁醇溶液滴于滤纸上，紫外灯
12、下观察荧光；然后喷三氯化铝试液，再在紫外灯下观察荧光颜色的变化。,鉴别,薄层色谱鉴定 样品：自制芦丁乙醇液（1mg/ml）。自制槲皮素乙醇液（1mg/ml）。 对照品：芦丁对照品乙醇液（1mg/ml）。槲皮素对照品乙醇液（1mg/ml）。 吸附剂：硅胶GCMC。 展开剂：氯仿甲醇甲酸(15：5：1)。 醋酸乙酯甲酸水(8：1：1)。 显色剂：喷三氯化铝试液，待乙醇挥干后，置紫外灯(365nm) 下观察（黄色荧光） 。 喷1%氯化铁水溶液1%铁氰化钾水溶液,实验三大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别,目的要求,1.掌握羟基葸醌类化合物的提取分离方法及主要检识反应。2.掌握pH梯度萃取法的原理及操作技
13、术。3.掌握利用溶剂的极性差异分离各类成分的方法。,大黄简介,蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum ，药用大黄Rheum officinale ，唐古特大黄Rheum tanguticum的根茎和根。主产于四川、西藏等地。 性能：苦、寒。 功效：通里攻下，清热解毒，活血化瘀等。,大黄主要化学成分简介,大黄素型蒽醌类成分 R1 R2 大黄酚 H CH3 大黄素 OH CH3 大黄素甲醚 OCH3 CH3 芦荟大黄素 H CH2OH 大黄酸 H COOH,蒽醌类成分酸性强弱与提取分离的关系,醌类化合物多具有酚羟基，故具有一定的酸性。在碱性水溶液中成盐溶解，加酸酸化后游离又可析出醌类化合物因
14、分子中羧基的有无及酚羟基的数目与位置不同，酸性强弱表现出显著差异以游离蒽醌类衍生物为例，酸性强弱按下列顺序排列：含-COOH含二个或二个以上-OH含一个-OH含二个或二个以上-OH含一个-OH根据醌类酸性强弱的差别，可用pH梯度萃取法进行这类化合物的分离工作,水解,大黄粗粉100g 置500ml圆底烧瓶，20%H2SO4150ml，加热 回流，水解2h，抽滤过。 药渣 水洗至pH7，抽干 药渣（60干燥）,提取,干燥药渣 装索氏提取器，用石油醚、乙酸乙酯各 200ml，回流提取至色浅 提取液(含总游离蒽醌),分离,鉴别,显色反应 取上述提取液： 加氢氧化钠溶液。 加醋酸镁试液。 观察颜色变化。
15、,鉴别,薄层色谱鉴别样品：取上述各步萃取物少许，甲醇溶解。 吸附剂：硅胶CMC-Na板，湿法铺板，105活化30min 展开剂：石油醚醋酸乙酯(8:2) 显色剂：365nm下观察荧光、5%氢氧化钾甲醇液或氨气薰,实验四 穿心莲中穿心莲内酯的提取、分离与鉴别,目的要求,1.掌握从穿心莲药材中提取亲脂性成分的原理和方法。2.掌握除去叶类药材中叶绿素的原理和方法。3.掌握内酯类成分的主要理化性质及鉴别方法。,穿心莲简介,为爵床科植物穿心莲（Andrographis paniculata（Burmf） Nees）的地上部分。性味性寒，味苦。 功能主治清热解毒，凉血，消肿。用于感冒发热、咽喉肿痛、口舌生
16、疮、顿咳劳嗽、泄泻痢疾、热淋涩痛、痈肿疮疡、毒蛇咬伤。,穿心莲主要化学成分简介,含穿心莲内酯（andrographolide）新穿心莲内酯（neoandrographolide）14-去氧穿心莲内酯穿心莲内酯甙（andrographoside）14-去氧穿心莲内酯甙（14-deoxyaandrographoside）以及黄酮类化合物等。,提取,穿心莲粗粉100g 95%乙醇600ml浸泡过夜，滤过。 滤液 减压回收乙醇至200ml 加入活性炭10g，80保温20min，抽滤 滤液,分离,滤液 减压回收乙醇至干，加入1015ml乙醇洗涤残渣， 趁热滤过。 滤液 10下静置过夜，析晶，滤过 穿心莲
17、内酯粗品,鉴别,取穿心莲内酯样品少许，乙醇溶解，加二硝基苯甲酸试液与乙醇制氢氧化钾试液等容的混合液12滴，即显紫红色。取穿心莲内酯样品少许，乙醇溶解，加碱性三硝基苯酚试液1滴，逐渐显棕色。取穿心莲内酯样品少许，乙醇溶解，加乙醇制氢氧化钾试液数滴，逐渐显红色。,鉴别,样品液：取穿心莲内酯样品少许，无水乙醇溶解（1mg/ml）。对照品液：取穿心莲内酯对照品，无水乙醇溶解（1mg/ml）。薄层板：硅胶G-CMCNa，或硅胶GF254-CMC-Na板展开剂：氯仿-乙酸乙酯-甲醇（4:3:0.4）显色：喷3、5-二硝基苯甲酸乙醇溶液与氢氧化钾乙醇溶液， 日光下观察，显红色。 365nm荧光下观察。,实验
18、五八角茴香挥发油的提取及鉴别,目的要求,1.掌握用水蒸气蒸馏法提取挥发油的原理及操作。2.掌握挥发油中化学成分的鉴别方法。,八角简介,为木兰植物八角茴香Illicium verum Hookf的果实。 性味性温，味辛。 功能主治温阳散寒，理气止痛。用于胃寒呕吐、腰痛。,八角茴香油中主要化学成分简介,含反式茴脑80%以上。主要含茴香醚（80%90%），-蒎烯、L-水芹烯、-萜品醇、黄樟醚、甲基胡椒酚、茴香醛、茴香酸、茴香酮、3，3-二甲烯丙基对丙烯苯醚等化学成分。,挥发油性质,挥发油(volatile oil)也称精油(essential oil)，是存在于植物体内的一类具有挥发性、可随水蒸气蒸
19、馏、与水不相混溶的油状液体。挥发油大多具有芳香嗅味，并具有多方面较强的生物活性，为中药所含有的一类重要化学成分。八角茴香油具有促进肠胃蠕动，缓解腹部疼痛，促进呼吸道分泌细胞分泌，抑菌等作用。用于健胃及调味。主要用作食品香料。也可用于分离反式茴脑，作为制备其他香料的原料。有较强的抗革兰阳性细菌和革兰阴性细菌的作用，对真菌也有一定抑制作用。,挥发油性质,组成挥发油的成分可分为如下四类 ：萜类化合物 、芳香族化合物 、脂肪族化合物 、其它类化合物 。常温下挥发油大多为无色或淡黄色的透明液体，多具浓烈的特异性嗅味（其嗅味常是其品质优劣的重要标志），有辛辣灼烧感。 挥发油常温下可自然挥发，挥发而不留油迹
20、。挥发油与空气及光线经常接触会逐渐氧化变质,提取的基本原理,根据挥发油能随水蒸气蒸馏出来而不分解的性质，可用水蒸气蒸馏法提取挥发油，并利用此性质来定量测定挥发油的含量。八角茴香挥发油比水轻，可用测定相对密度在1.0以下的挥发油测定仪。,提取,八角茴香100g 置蒸馏瓶中，加水400ml， 水蒸气蒸馏5-6h 蒸馏液 加食盐饱和，置分液漏斗，静置， 分取上层挥发油 挥发油,鉴别,芳香性：嗅挥发油的气味。挥发性：将挥发油滴于滤纸屑上，放置后无油斑残留。与脂肪油对照。测定折光率。不饱和性：将挥发油滴入0.5ml溴的四氯化碳溶液中，溴褪色。,鉴别,薄层色谱鉴定样品：八角茴香挥发油乙醇液。对照品：茴香醚对照品乙醇液。吸附剂：硅胶GCMC。展开剂：石油醚醋酸乙酯(9:1)。显色剂：2%高锰酸钾水溶液。 1%香草醛浓硫酸试剂。 0.2%2，4二硝基苯肼试剂。 0.05%溴甲酚绿乙醇溶液。 三氯化铁乙醇溶液。,
