1、姓名：武艳军导师：龚道清 教授专业：动物营养与饲料科学,血球蛋白粉来源鉴定及其酶解小肽对断奶仔猪营养生理效应研究,2018/10/16,动物科学与技术学院,1,目录,2018/10/16,动物科学与技术学院,2,研究背景,2018/10/16,动物科学与技术学院,3,1、动物血液制品的生物安全性问题,2018/10/16,动物科学与技术学院,4,一、动物血液及血液制品本身存在一定量的病毒 Polo 等（2005）证实在喷雾干燥血浆和血球蛋白粉中有一定数量的病毒存在 Roodik等（2006）研究发现动物血液制品中病毒数量大于百万分之一的情况下有传播疾病的风险 （宰前宰后检疫、喷雾干燥、超滤纳滤
2、、ERP、PRS）二、动物血源管理混乱，易混入牛羊源性成份，增加疯牛病等疾病传播机率（中国屠宰前3强：5%，美国屠宰前4强：50%，荷兰前3强：74%，丹麦最大企业：80%）,1、动物血液制品的生物安全性问题,2018/10/16,动物科学与技术学院,5,早期断奶仔猪由于生理和免疫功能发育不完善，容易受到营养、环境、心理等多种应激影响而引发“早期断奶应激综合症(PRAD)”，给畜牧业造成了很大的经济损失。,2、“仔猪早期断奶应激综合症”及其解决方案,图2 仔猪早期断奶应激综合症,2018/10/16,动物科学与技术学院,6,2、“仔猪早期断奶应激综合症”及其解决方案,传统解决方案：抗生素、药物
3、添加剂（耐药性、药物残留、微生物区系的破坏）Funderburke（1990）：心理、环境、营养应激中营养应激最大营养解决方案之一：选用对消化道发育阻碍小的生物活性物质来配制断奶仔猪日粮,图3 生物活性物质,2018/10/16,动物科学与技术学院,7,三、小肽营养在早期断奶仔猪上的研究进展,断奶仔猪日粮中添加小肽可显著提高平均日增重和采食量，降低料重比和腹泻率，一定程度缓解和治疗“早期断奶应激综合症”。王贤勇，王彬，郑云峰(2006)；张常明(2007)；杨维仁，周绍，祝平等(2008)通过3种方式生产的植物小肽对生产性能和血液生化指标无显著影响。孙占田等(2007)目前研究较多的是植物小肽
4、，关于动物小肽（血液小肽）还主要停留在工艺研究阶段，对于作用机理及最佳添加量研究的很少。,2018/10/16,动物科学与技术学院,8,研究目的,建立一套PCR鉴别动物血球蛋白粉来源的技术研究酶解血球小肽对早期断奶仔猪的营养生理效应,2018/10/16,动物科学与技术学院,9,试验一、PCR鉴别动物血球蛋白粉来源方法建立,2018/10/16,动物科学与技术学院,10,牛、鸡和混合血球蛋白粉由国家饲料检测中心武汉分中心提供；猪血球蛋白粉为上海杰隆生物制品有限公司提供；同时还在市场上抽检部分猪血球蛋白粉样品。,表1 试验所用引物序列及扩增片段长度,试验材料,2018/10/16,动物科学与技术
5、学院,11,试验结果和分析,1、样品DNA提取和PCR测序结果,表2 样品DNA提取和PCR测序结果,饲料中DNA提取方法主要有4种:Chelex法、SDS法、GuSCN法和试剂盒法DNA提取方法在2种物种间是稳定的，3对特异性引物可较为准确的扩增出目的片段,2018/10/16,动物科学与技术学院,12,图1 检测灵敏度分析A为猪血球蛋白粉灵敏度检测；B为鸡血球蛋白粉灵敏度检测；C为牛血球蛋白粉灵敏度检测；1、2、3、4分别为加入量为1.0 %、0.5 %、0.1 %和0.05 %的血球蛋白粉。,2、灵敏度检测结果,杨宝华等（2001）采用GuSCN法提取DNA，检测灵敏度为0.125 %；
6、李林等(2004)使用Promega公司的试剂盒提取DNA，检测灵敏度为0.001 %本实验结果：0.05 %（动物源性饲料检测要求灵敏度 0.1 % ）,2018/10/16,动物科学与技术学院,13,图2 鸡、牛、猪的特异性引物样品检测PCR电泳图15是用鸡特异引物分别检测鸡、牛、猪、添加1%猪血球蛋白粉的混合血球蛋白粉和添加10%猪血球蛋白粉的混合血球蛋白粉，610是用牛特异性引物检测以上5种血球蛋白粉，1115是用猪特异性引物检测以上5种血球蛋白粉。M为分子量标记。,3、特异性检测结果,试验中所选用的3对引物可以较为准确的扩增出所需的目的片断，但是在用牛特异性引物检验鸡血球粉时，有微弱
7、的阳性。 血球蛋白粉样品是使用同一个喷雾干燥塔按照先牛后鸡的顺序生产，制备过程中混杂所致。,2018/10/16,动物科学与技术学院,14,图3 市场产品检验结果13为用猪、牛、鸡引物检测样品1，46是用猪、牛、鸡引物检测样品2，79是用猪、牛、鸡引物检测样品3，1012是用猪、牛、鸡引物检测样品4，1315是用猪、牛、鸡特异引物检测样品5，M为分子量标记。,4、市场产品抽检结果,随着政府立法对动物源性饲料使用的规范以及PCR检测技术的发展，猪血球蛋白粉中已经很少添加反刍动物血球蛋白粉，但仍有部分厂家的产品中会检测出鸡血球蛋白粉。,2018/10/16,动物科学与技术学院,15,试验二、酶解血
8、球小肽对断奶仔猪营养生理效应研究,2018/10/16,动物科学与技术学院,16,试验动物与日粮,选择35日龄、体重胎次相近的“长大”二元去势公猪160头 基础日粮由上海高得饲料有限公司生产，基础日粮组成及营养成分见表1，试验组日粮为基础日粮中添加0.5%、1.0%、2.0%的酶解血球小肽，通过制粒工艺加工而成。,表1 基础日粮组成及营养成份表,2018/10/16,动物科学与技术学院,17,试验设计,饲喂28天,每组选择4头仔猪采血,血液生化指标,160头仔猪随机分成4组，分别为对照组、0.5%、1.0%、2.0%小肽组，每组4个重复，每个重复10头仔猪。,消化道指标,小肠形态指标,酶活性指
9、标,PH值和器官指数,对照组和0.5%小肽组各取2只屠宰取样,生长性能指标,2018/10/16,动物科学与技术学院,18,试验结果和分析,表2 酶解血球小肽对断奶仔猪体重和平均日增重的影响,注：同一行中肩注相同字母者表示差异不显著(P0.05)，不同小写字母者表示差异显著(P0.05)，相同大写字母表示差异极显著(P0.01)，下表同。,1、酶解血球小肽对断奶仔猪生产性能的影响,2018/10/16,动物科学与技术学院,19,图1 酶解血球小肽对断奶仔猪平均日增重的影响,曹光辛(1998)鹌鹑、王碧莲(2001)欧鳗、王贤勇（2007）仔猪研究相一致：合适的小肽添加量可提高生产性能，超过一定
10、限度后生产性能差异不显著，甚至效果更差。分析：随着仔猪日龄的增加，过量的小肽在大肠后段发酵产生氨气和有毒有害物质，增加仔猪代谢负担，降低其蛋白利用率，从而影响生产性能。,2018/10/16,动物科学与技术学院,20,图2 酶解血球小肽在断奶仔猪日粮中最适添加量,X=0.623,2018/10/16,动物科学与技术学院,21,表3 酶解血球小肽对断奶仔猪平均日采食量、料重比和腹泻率的影响,Miller（1984）、陈代文（1995）、张莉莉（2002）等学者一致认为：仔猪肠道对日粮抗原产生过敏性是导致其腹泻的原发性原因。 结果：小肽比植物蛋白有更低的过敏原性，利于断奶仔猪的吸收利用,2018/
11、10/16,动物科学与技术学院,22,表4 酶解血球小肽对早期断奶仔猪血液生化指标影响,2、酶解血球小肽对断奶仔猪血液生化指标的影响,血液生化指标可以反映出机体各组织器管的代谢状况，间接反映生长性能：TP、ALG：蛋白代谢和免疫力；IgG:介导体液免疫；BUN：蛋白利用率ALT：与增重、饲料利用率呈一定程度正相关；LDH：与动物抗应激能力呈负相关结果：小肽可提高仔猪对蛋白利用率，增强机体免疫力和抗应激能力,2018/10/16,动物科学与技术学院,23,表5 酶解血球小肽对早期断奶仔猪器官指数的影响,3、酶解血球小肽对断奶仔猪消化道指标的影响,结果：小肽组胸腺和颌下淋巴结指数显著高于对照组，其
12、它指标差异不显著分析：脾脏功能繁多，除了是免疫功能外，更是机体最大的滤血器管,2018/10/16,动物科学与技术学院,24,表6 酶解血球小肽对早期断奶仔猪肠道PH的影响,结果：小肽组和对照组差异不显著，有一定程度的降低分析：小肽提高仔猪对蛋白的利用率，减少肠道后段蛋白发酵和NH3产生，降低PH值,2018/10/16,动物科学与技术学院,25,表7 酶解血球小肽对早期断奶仔猪肠道形态的影响,结果：小肽组十二指肠绒毛高度，空肠、回肠绒腺比显著高于对照组，回肠隐窝深度显著低于对照组。分析：小肽具有生理调节功能，能有效刺激和诱导小肠组织功能的上升，促进小肠发育、成熟以及受损肠粘膜细胞的修复。,2
13、018/10/16,动物科学与技术学院,26,表8 酶解血球小肽对早期断奶仔猪肠道酶活性的影响,1、小肽组十二指肠淀粉酶、胰蛋白酶、蔗糖酶，空肠胰蛋白酶，回肠淀粉酶活性显著高于对照组。（PH、生理调节功能）2、脂肪酶差异均不显著。（日粮脂肪水平影响）3、二糖酶的分布规律：粘膜高于内容物，而粘膜中又以空肠最高。,2018/10/16,动物科学与技术学院,27,研究结论,本研究建立了一套PCR鉴别动物血球蛋白粉来源的方法，该方法DNA提取结果稳定，引物准确性和特异性较好，检测灵敏度达到0.05%，对今后动物血球蛋白粉来源检测既可以单独使用也可以配伍其他方法进行质量控制。在日粮中添加不同水平的小肽，以0.5%小肽组综合生产性能最佳，通过二次曲线得出断奶仔猪日粮中小肽最佳添加量为0.623%。在日粮中添加0.5%的小肽可提高仔猪对蛋白质的利用率，促进免疫器官的发育，增强断奶仔猪对各种应激和疾病的抵抗力。本试验条件下，日粮中添加0.5%小肽可以促进肠绒毛的发育和消化腺的成熟，一定程度上降低肠道的PH值，有利于断奶仔猪对营养物质的吸收和利用。,2018/10/16,动物科学与技术学院,28,Thanks for your attention!,2018/10/16,动物科学与技术学院,29,
