1、中国药科大学本 科 毕 业 论 文论文题目 HPLC 法测定人血浆中亚胺培南的药物浓度英文题目 Determination of Imipenem in Human Plasma by HPLC专 业 药物分析院 部 药学院学 号姓 名指导教师课 题 完成 场 所论文工作时间： 2015 年 3 月 至 2015 年 5 月HPLC 法测定人血浆中亚胺培南的药物浓度目录摘要 .2前言 .4第二章 仪器与试药 .61.1 仪器 .61.2 药品与试剂 .6第二章 方法与结果 .72.1 色谱条件 .72.2 溶液的配制 .72.2.1 标准溶液的配制 .72.2.2 内标溶液的配制 .82.2.
2、3 稳定剂的配制 .82.3 血浆样品预处理 .82.4 方法专属性（考察血浆内源性物质的干扰） .82.5 标准曲线及定量下限 .102.6 回收率试验 .112.7 精密度试验 .132.8 稳定性试验 .14第三章 讨论 .153.1 亚胺培南的立体异构 .153.2 流动相组分的选择 .15中国药科大学本科生毕业论文（设计）13.3 蛋白沉淀方法的选择 .163.4 内标化合物的选择 .163.5 血浆中亚胺培南的稳定性以及稳定剂的选择 .16第四章 临床应用 .17第五章 结论 .17参考文献 .18致谢 .20中国药科大学本科生毕业论文（设计）2HPLC 法测定人血浆中亚胺培南的药
3、物浓度学号：1141528 姓名：张雪晶摘要：目的 建立并优化一种快速、简单、可靠、灵敏度高、选择性好的高效液相色谱法来测定人血浆中亚胺培南的浓度，为其临床合理用药和药代动力学研究提供理论依据为其临床合理用药和药代动力学研究提供试验方法。方法 以比阿培南(Biapenem ,BIP)作为内标，以 0.5 mol/L(pH6.0)吗啉乙磺酸(4-Morpholineethanesulfonic acid ，MES) 作为稳定剂，血浆样品预处理采用溶剂解法沉淀蛋白法：乙腈：含药血浆以 3:1 的体积比一步沉淀蛋白，经高速冷冻离心机离心后，取上清液进样。色谱柱为 Alltima HP HILIC 5
4、m(4.6 mm250 mm)；流动相为 10mMol10mmol/L 乙酸铵：乙腈（40:60）；流速为1.0mL/min；柱温：35 ；检测波长:298nm。结果 亚胺培南在 1?50g/mL 的浓度范围内线性关系良好，R 2=0.9997；定量下限为 1g/mL；高，中，低，LLOQ 浓度点的亚胺培南提取回收率相一致，均在 60%左右，并且高，中，低，LLOQ4 个浓度点的亚胺培南的提取回收率的 RSD 均小于 15%，具有良好的精密度和重现性；日内、日间 RSD 均小于 15%。结论 本方法操作简单、快捷、准确、灵敏度高，重复性和选择性良好，适用于临床上对亚胺培南进行血药浓度监测的快速
5、。关键词：高效液相色谱；亚胺培南；血药浓度Determination of Imipenem in Human Plasma by HPLCAbstract: Objective To establish and optimize a fast, simple, reliable, high-sensitivity and good-selectivity High high Performance lLiquid cChromatography method for determining the concentration of imipenem in human plasma for p
6、roviding a pratical methoda theoretical basis for pharmacokinetic studies and clinical use of imipenemdrugs. Methods: Plasma samples were spiked with 0.5mol/L(pH6.0) MES as the stabilizer solution, biapenem as the internal standard, plasma protein was precipitated with acetonitrile of 3 times volumn
7、 of it, after mixed for 3 mins, they were containing drug plasma followed through centrifuginged with high speed freezing centrifuge and the supernatant phase was injected. Separation was achieved on an 中国药科大学本科生毕业论文（设计）3Alltima HP HILIC column 5m(4.6 mm250 mm). The mobile phase was a mixture of 10m
8、Mol10mmol/L ammonium acetate and acetonitrile (40:60,v/v), and the pump flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 35 . The uV UV detection wavelength was 298 nm. Results: Calibration curves of imipenem showed good linear regression in the range of 1?50 g/mL(R2= 0.9997). The lower limit of
9、 quantification of imipenem was 1?g/mL. The extraction recovery between the high, medium, low and LLOQ concentration of imipenem in quality control samples was consistent with each other, and was around 60%. The RSD of the four concentration level QC sample was less than 15% with good precision and
10、reproducibility. And Intra- and inter-day variations were MIC)的情况下才能获得。对于重症患者而言，其病理生理存在特殊性，亚胺培南在其体内药物分布和半衰期等将发生改变，血药浓度个体差异大并且将难以预测。据国外文献报道，在推荐剂量下使用亚胺培南治疗由铜绿假单胞菌或鲍曼不动杆菌引起的肺炎，约有15% 30%的患者无法达到最佳治疗效果 76。而当大剂量给予亚胺培南治疗严重感染如中国药科大学本科生毕业论文（设计）5感染性心内膜炎、骨髓炎等，又容易引起惊厥、 意 识障碍等严重中枢神经系统不良反应8，因此，在临床治疗中对亚胺培南进行血药浓度监测是
11、十分必要的，特别是对于一些重症监 护 室患者，严重感染已成为其主要死亡原因之一，对其进行亚胺培南 TDM 工作意义重大，有利于降低死亡率，改善临床预后。要实现亚胺培南的临床药物浓度监测，就必需建立简便、快速、灵敏、稳定的定量测定人血中亚胺培南浓度的方法，目前，国内外已有文献对建立人血浆中亚胺培南浓度测定的 HPLC 法进行了研究和阐述，对本实验的开展具有一定的借鉴和指导意义，但是色谱条件不同，所建立 HPLC 方法学也将存在差异。考虑到不同实验室实验条件的差异性（主要是色谱条件的差异），再加上针对于重症患者在临床上药动学/药效学研究数据相对的缺乏，经典的药动学参数不适用于重症患者，临床急需这类
12、患者的药动学研究数据作为用药依据，所以很有必要结合本临床实验室实验条件，在相关文献的指导下，建立适合人血浆中亚胺培南浓度测定的 HPLC-UV 方法，并利用药代动力学原理将其应用于临床患者的血药浓度监测，以获得优化的疗效和产生低细菌耐药性，提供药动学研究数据用以指导亚胺培南临床个体化用药以确保安全性和有效性。图 1.亚胺培南的分子结构中国药科大学本科生毕业论文（设计）6第二章 仪器与试药1.1 仪器岛津高效液相色谱系统（日本 Shimadzu 公司）：包括 LC-20AD 泵，SPD-20A 紫外检测器，DGU-20A 在线脱气单元，CBM-20A 系统控制器，CTO-20A 柱温箱，SIL-
13、20A自动进样器；十万分之一天平（德国 Sartorius 公司）； Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore）； KH5200B 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；VIicro CL21R型高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific 公司），IKA GENIUS 3 涡旋震荡仪（德国IKA 公司，）， PHS-25 pH 计（上海精密科学仪器厂），移液枪移液器（德国Eppendorf 公司）。1.2 药品与试剂血浆样品（东南大学附属中大医院提供）；乙腈（色谱纯，TEDIA 公司）；乙酸铵（色谱纯，西陇化工股份有限公司）；亚胺培南标准品 IMP（公司）
14、；比阿培南标准品 BIP（公司）；吗啉乙磺酸 MES（Aladdin Industrial Corporation ShangHai China）；氢氧化钠 NaOH(上海展云化工有限公司) ；超纯水（美国 MILLIPORE 设备）中国药科大学本科生毕业论文（设计）7第二章 方法与结果2.1 色谱条件Alltima HP HILIC 色谱柱（4.6mm250mm ，5m ）；流动相：乙腈-10mmol/L 乙酸铵（60:40，V/V）；流速：1mL/min;柱温：35；检测波长：298nm ；洗脱方式：梯度洗脱；进样量：25L梯度洗脱时间程序如下表：时间 min 单元 处理命令 值0.010
15、.01泵 FlowFlow0.40.66.306.30泵 FlowFlow0.40.67.007.00泵 FlowFlow0.60.49.009.00泵 FlowFlow0.60.49.309.30泵 FlowFlow0.40.612.01 控制器 Stop2.2 溶液的配制2.2.1 标准溶液的配制采用十万分之一天平精密称取亚胺培南标准品适量，用稀释液（ACN：MES ，60：40）配制成 1mg/mL 的亚胺培南标准贮备液，于-20的条件下冰箱保存备用。精密量取适量亚胺培南标准贮备液，采用稀释液定量稀释，配制成质量浓度从高到底依次为 500，400，200,100,50,20,10g/mL
16、 的亚胺培南系列标准品溶液，系列亚胺培南标准品中国药科大学本科生毕业论文（设计）8溶液现用现配。2.2.2 内标溶液的配制采用十万分之一天平精密称取比阿培南适量，用甲醇：水（1:2 ）溶解稀释得1mg/mL 的比阿培南内标贮备液，冰箱保存备用。精密量取内标贮备液适量用甲醇：水（1:2）定量稀释，配制成 100g/mL 的内标溶液在 -20的条件下保存，临用时取出。2.2.3 稳定剂的配制采用十万分之一天平精密称取吗啉乙磺酸（MES）适量，用超纯水（美国MILLIPORE 设备制得）溶解后，采用 5Mol/L 的氢氧化钠溶液，pH 计调 pH 至 6.0，配制成 0.5mMol/L 的稳定剂吗啉
17、乙磺酸 MES（pH6.0 ）溶液，冷藏保存于 8的条件下，临用时取出。2.3 血浆样品预处理本实验在临床上所获得的血浆与稳定剂 1:1 混合均匀后，移液枪精密吸取浓度为100g/mL 的比阿培南内标溶液液 10L，置于 1.5mL 的 EP 管中，再准确加入血浆样品（已与稳定剂混合均匀）100L，涡旋仪上涡旋混匀 30 s 后，加入乙腈 300L（含药血浆：乙腈，1:3，V/V），涡旋 1 min，在高速冷冻离心机中以 20000g，4，离心 5 min，吸取上清液 200L 于进样小瓶中，进样 25L。2.4 方法专属性（考察血浆内源性物质的干扰）采用“2.1”项下的本实验的色谱条件，考察空白血浆（6 个不同个体的空白血浆和6 个不同个体的空白血浆的混合血浆），空白血浆加入亚胺培南标准品溶液及内标溶液，以及给药后临床患者的血浆样品色谱图，结果，注射用亚胺培南的保留时间在 5.1 左右，内标化合物比阿培南的保留时间在 5.5 左右，二者分离度 R1.5 达到定量要求，而且二者峰形对称性良好，血浆中的内源性物质以及西司他汀钠均在 1.5-4.5min 内出峰，对亚胺培南及内标物的测定不存在干扰，并且本实验色谱条件能够抑制亚胺培南构象异构体的分离，有效避免亚胺培南色谱峰形的列分或者展宽。高效液相色谱图如下：
