1、饲料中氨基酸的测定 高效液相色谱法河南省地方标准编制说明一、编制的目的和意义氨基酸是羧酸碳原子上的氢原子被氨基取代后的化合物，氨基酸分子中含有基和氨羧基两种官能团。与羟基酸类似，其可按照氨基连在碳链上的不同位置而分为 -，-，-.w-氨基酸，但经蛋白质水解后得到的氨基酸都是 -氨基，它们是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，是维持动物生长所必需的营养物质，其种类和含量是评价饲料蛋白质营养价值的根本指标，测定饲料中的氨基酸具有非常重要的意义。随着畜牧养殖业的迅猛发展，对饲料营养成分分析也提出了更高的要求。饲料分析已从比较单一的高含量营养成分，如蛋白质、脂肪等的总量分析，深入到比较复杂的微量营养素，
2、如多种氨基酸、维生素、微量元素及饲料中的有害物质等分析。目前，饲料产品国标中氨基酸的测定采用的是离子交换柱后茚三酮衍生色谱法。但众所周知，该方法使用的氨基酸自动分析仪价格昂贵（约 70 万左右），专属性强，只能分析氨基酸，且分析速度慢。而采用高效液相色谱法测定氨基酸，具有价格便宜，分析速度快、灵敏度高、操作简便的特点，其次，目前很多实验室都配置了高效液相色谱仪，其价格易于接受（约 10 万左右），而且它的分析范围很广，可测定饲料中的氨基酸、维生素、碳水化合物、脂肪酸、有机酸、添加剂(风味剂、防腐剂等)和有害物质(如黄曲霉素、棉酚和农药残留等)，因而实现了一机多用的可能。相比于目前国标方法 GB
3、/T 18246-2000饲料中氨基酸的测定规定的氨基酸分析方法，高效液相则具有较好的通用性，应用范围广且市场占有率高，利于推广。随着高效液相色谱技术的日趋成熟和普及，高效液相色谱法必将成为各检测机构测定氨基酸含量的主要方法。2、任务来源及编制原则和依据2.1 任务来源根据河南省质量技术监督局文件河南省质量技术监督局关于下达 2017 年第四批河南省地方标准制修订计划的通知豫质监标发2017355 号的要求，由河南海瑞正检测技术有限公司负责对项目编号为 20174210667 的河南省地方标准饲料中氨基酸的测定 高效液相色谱法的起草、制定工作。2.2 编制原则本标准编制符合国家法律、法规和政策
4、，本着严格遵循“规范性、实用性、统一性、协调性、完整性”的原则，开展了本次研究工作，填补检测方法单一的空白，并注重标准的可操作性。2.3 编制依据本标准在编制过程中参照的主要标准及依据如下：GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 10648 饲料标签GB/T 14699.1 饲料 采样GB/T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定GB 19489 实验室 生物安全通用要求3、编制过程2017 年 11 月 9 日,收到河南省质量技术监督局下达的标准制修订通知，本标准被列入 2017 年第四批河南省地方标准制修订计划。收到制定计划后，作为项目主持单位，河南海瑞正检测技术有限公司
5、成立了标准起草小组。小组成员经充分讨论和酝酿，制订了实施方案，就起草工作进行调研、汇总、分析、试验验证、制定标准框架、起草标准进度等内容，进行了明确的分工。2017 年 12 月标准起草小组相关人员就着手收集了饲料中氨基酸的测定的标准、书籍资料等，并分门别类整理出了有关方面的研究论文、技术文献资料。根据标准制定相关要求，考虑与现行国家标准的一致性原则，重点研究国内外有关饲料中氨基酸检测的标准体系。2018 年 1 月3 月，标准编写小组编写制定整理出了标准编写所需的资料，为起草标准作出了多方面的准备。与此同时，实验室相关人员按计划进行了大量试验验证工作。2018 年 4 月，标准编写小组对有关
6、文献资料进行了梳理总结，同时召开了标准起草小组会议，对编写提纲进行了讨论，标准编制严格按照标准化工作导则（GB/T 1.1）关于标准的结构和编写规定等要求进行，初步确定了标准框架。根据试验资料和所有参与试验人员意见，在科学分析的基础上，组织有关专家规定了适用范围、规范性引用文件、方法原理、设备材料、测定步骤、结果的表述、试验结果的判定等，起草了标准草案。2018 年 5 月，标准起草单位将标准草案送至饲料中氨基酸检测的有关专家学者征求意见，编制出了河南省地方标准征求意见汇总表。 2018 年 6 月，标准起草小组根据征求专家学者反馈的指导意见，对标准草案的每一组数据、每一句表述进行了认真而全面
7、的补充、调整和完善，并经多次小组讨论最终形成饲料中氨基酸的测定 高效液相色谱法征求意见稿并完成上报工作。主要起草人及其任务分工：项目主持人：兰尊海，河南海瑞正检测技术有限公司，主持本项地方标准的制定与编写。主要起草人：兰尊海：河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定和技术推广。单慧燕：河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定和应用。易善平：河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制校订和应用。薛宁：河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的制定。许亚楠：河南海瑞正检测技术有限公司，负责标准的校订和应用。李培娜：河南海瑞正检测技术有限公司，负责此标准方法的应用。孙世雯：河南海瑞正检测技术有限公司，
8、负责标准校订和应用。4、主要内容的确定（一）与国标方法 GB/T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定的对比：1.出峰时间进行比较根据标准要求，用高效液相色谱法和国标方法 GB/T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定 ，对氨基酸样品进行分析，出峰时间如图 1、图 2 所示，氨基酸分析仪出峰完全在 110 min 左右，而高效液相色谱法的出峰时间在 36 min左右，大大节省了检测时间，提高了工作效率。图 1 氨基酸自动分析仪-氨基酸色谱图图 2 高效液相色谱法-17 种氨基酸色谱图2.结果准确性进行比较选用浓缩料和脱脂鱼粉两类饲料样品，分别进行本方法和国标方法 GB/T 18246-
9、2000饲料中氨基酸的测定，两种方法进行比对，结果从表 1 可以看出，两组数据的相对偏差分别为 0.50%、0.28%，远远小于标准要求 4.0% 的相对偏差，说明高效液相测定氨基酸结果准确可靠，方法可行。表 1 两种方法氨基酸的测定结果本标准 GB/T 18246 本标准 GB/T 18246组分名称 浓缩料 脱脂鱼粉天门冬氨酸（asp） 3.28 3.19 6.30 6.22谷氨酸（glu） 5.49 5.46 9.70 9.84丝氨酸（ser） 1.37 1.36 2.68 2.84精氨酸（arg） 2.23 2.20 4.20 4.30甘氨酸（gly） 1.24 1.20 4.55 4
10、.52苏氨酸（thr） 1.08 1.07 2.99 3.01脯氨酸（pro） 1.37 1.34 3.02 2.90丙氨酸（ala） 1.25 1.20 4.45 4.37缬氨酸（val） 1.35 1.35 3.60 3.45蛋氨酸（met） 0.57 0.56 2.15 2.09胱氨酸（cys） 0.26 0.26 0.53 0.50异亮氨酸（ile） 1.25 1.31 3.14 3.06亮氨酸（leu） 2.19 2.16 5.53 5.34苯丙氨酸（phe） 1.45 1.44 2.92 2.87组氨酸（his） 0.87 0.87 1.85 1.87赖氨酸（lys） 1.86 1
11、.86 5.80 5.82酪氨酸（tyr） 0.89 0.88 2.24 2.30氨基酸总和 27.99 27.71 65.67 65.30相对偏差（%） 0.50 0.28（二）高效液相色谱法实验条件的优化：1.样品前处理优化条件酸解剂用量的优化：分别取酸解剂 5 mL、10 mL、15 mL，由表 2 实验结果表明酸解剂为 5 mL 时，结果较低，说明水解不完全，在酸解剂用量为 10 mL 和 15 mL 时，结果一致，说明水解完全，本着节约的原则，为减少浪费，10 mL 为最佳酸解剂的用量。表 2 不同酸解剂用量测定结果酸解剂（mL)组分名称5 10 15天门冬氨酸（asp） 5.96
12、6.28 6.28谷氨酸（glu） 8.98 9.63 9.57丝氨酸（ser） 2.09 2.32 2.38精氨酸（arg） 3.84 4.10 4.05甘氨酸（gly） 4.34 4.62 4.63苏氨酸（thr） 2.76 2.96 2.98脯氨酸（pro） 2.89 3.10 3.09丙氨酸（ala） 4.24 4.56 4.52缬氨酸（val） 3.45 3.68 3.67蛋氨酸（met） 2.02 2.22 2.22胱氨酸（cys） 0.46 0.52 0.53异亮氨酸（ile） 2.92 3.09 3.05亮氨酸（leu） 5.08 5.45 5.44苯丙氨酸（phe） 2.72
13、 2.76 2.76组氨酸（his） 1.63 1.74 1.68赖氨酸（lys） 5.40 5.74 5.71酪氨酸（tyr） 2.06 2.19 2.15氨基酸总和 60.84 64.94 64.712.衍生温度的优化:将衍生温度设置为 50 、55 、60 、65 、70 五个梯度，其余参数同标准要求，结果如表 3 所示，衍生温度在 50 到 60 时，结果处于上升趋势，在 60 到 65 时，结果稳定，在 70 时，结果明显偏高，由此说明，温度低于 60 时，衍生不完全，结果偏低；温度高于 65 时，衍生试剂里的有机试剂易挥发，导致结果偏高。综合考虑，衍生温度选定在 60 时较为合适。
14、表 3 不同衍生温度测定结果衍生温度（)组分名称50 55 60 65 70天门冬氨酸（asp） 5.50 5.99 6.29 6.27 6.63谷氨酸（glu） 8.82 9.27 9.66 9.59 9.84丝氨酸（ser） 2.23 2.29 2.32 2.26 2.30精氨酸（arg） 3.85 4.04 4.09 4.08 4.16甘氨酸（gly） 4.34 4.49 4.61 4.58 4.82苏氨酸（thr） 2.83 2.96 2.98 2.95 3.15脯氨酸（pro） 2.93 2.99 3.09 3.08 3.21丙氨酸（ala） 4.25 4.39 4.55 4.53
15、4.73缬氨酸（val） 3.45 3.53 3.66 3.64 3.76蛋氨酸（met） 2.11 2.12 2.23 2.26 2.33胱氨酸（cys） 0.48 0.50 0.54 0.54 0.55异亮氨酸（ile） 2.92 2.96 3.09 3.08 3.23亮氨酸（leu） 5.16 5.25 5.44 5.43 5.65苯丙氨酸（phe） 2.51 2.73 2.75 2.75 2.88组氨酸（his） 1.49 1.65 1.74 1.77 1.87赖氨酸（lys） 5.37 5.56 5.75 5.73 5.92酪氨酸（tyr） 1.98 1.98 2.18 2.17 2
16、.27氨基酸总和 60.19 62.69 64.97 64.69 67.303.衍生时间的优化将衍生时间设置为：20 min、25 min、30 min、35 min，结果如表 4 数据可以看出，衍生时间由 20 min 到 30 min 时，结果呈上升趋势，表明衍生时间低于 30 min 时，衍生不完全，实验结果偏低；衍生时间为 30 min 和 35 min时，结果相同，说明在 30 min 时样品已经衍生完全，本着提高效率、节约资源的原则，确定 30 min 为最佳衍生时间。表 4 不同衍生时间实验结果衍生时间（min)组分名称20 25 30 35天门冬氨酸（asp） 5.62 6.0
17、2 6.29 6.30谷氨酸（glu） 8.81 9.22 9.64 9.67丝氨酸（ser） 2.10 2.32 2.37 2.35精氨酸（arg） 3.79 3.92 4.12 4.15甘氨酸（gly） 4.33 4.45 4.70 4.67苏氨酸（thr） 2.77 2.93 2.98 3.02脯氨酸（pro） 2.89 2.96 3.13 3.13丙氨酸（ala） 4.21 4.33 4.56 4.57缬氨酸（val） 3.43 3.52 3.68 3.62蛋氨酸（met） 2.06 2.11 2.22 2.26胱氨酸（cys） 0.51 0.54 0.56 0.53异亮氨酸（ile） 2.89 2.95 3.14 3.11亮氨酸（leu） 5.10 5.20 5.53 5.49苯丙氨酸（phe） 2.55 2.64 2.77 2.77组氨酸（his） 1.37 1.56 1.68 1.73赖氨酸（lys） 5.37 5.49 5.78 5.73酪氨酸（tyr） 2.03 2.08 2.22 2.22氨基酸总和 59.81 62.23 65.38 65.314.方法精密度实验取试样溶液一份，按照本标准要求的色谱条件重复进样 6 次，结果如表 5 所示,氨基酸各组分的相对标准偏差在0.63%2.28%之间，实验结果表明：该方法测定氨基酸有较好的重复性。
