1、壳聚糖修饰植物甾醇脂质体的制备及稳定性研究程铭 1 焦文佳 1 陶冶 1 夏廉臣 1 王雪晖 1 王春维 1,2（武汉轻工大学食品科学与工程学院 1，武汉 430023；国家粮食局粮油资源综合开发工程技术研究中心 2，武汉 430023）摘 要 采用乙醇注入法制备植物甾醇脂质体（Phytosterol Liposome，PLs） ，并以不同浓度壳聚糖进行修饰优化制备工艺；通过粒径、PdI、电位和稳定性指数，分析评价了壳聚糖修饰植物甾醇脂质体（Chitosan modified Phytosterol Liposome，CS-PLs）在不同环境下的稳定性；并对壳聚糖修饰前后 PLs进行了体外胃肠
2、消化环境稳定性试验。结果表明：当壳聚糖浓度为 0.3mg/mL 时可获得粒径小、分布均一的 CS-PLs；且 pH、温度和离子强度及种类均对 CS-PLs 稳定性有显著影响；PLs 经壳聚糖修饰前后，胃消化稳定性均良好，但在模拟肠消化环境中，经壳聚糖修饰后的 PLs 表现出更好的稳定性。关键词 植物甾醇脂质体 壳聚糖 稳定性 体外消化Preparation and stability properties of chitosan modified phytosterol liposomesCheng Ming1 Jiao Wenjia1 Tao Ye1 Xia Lianchen1 Wang X
3、uehui1 Wang Chunwei1,2(College of Food science and Engineering, Wu Han Polytechnic University1, Wu Han 430023;Grain and Oil Resources Comprehensive Exploitation and Engineering Technology Research Center ofState Administration of Grain2, Wu Han 430023)Abstract Phytosterol liposomes (PLs) were prepar
4、ed by ethanol injection method, and the preparation process was optimized by chitosan modified with different concentration. The stability of chitosan modified phytosterol liposomes (CS-PLs) was analyzed and evaluated by particle size, PdI, Zeta potential and TSI in different environments. It also c
5、ompared the stability of PLs with CS-PLs in vitro gastrointestinal digestion environment. The results indicated that the small and uniform particle size of CS-PLs can be obtained with chitosan concentration of 0.3mg/mL. The pH, temperature, ionic strength and type have great effect on the stability
6、of CS-PLs. The PLs with or without chitosan modified were stable in gastric digestion; but CS-PLs showed better stability in simulated intestinal digestion than PLs.Key words Phytosterol liposomes, Chitosan, Stability, In vitro digestion中图分类号：（TS201.2） 文献标识码： 文章编号： 植物甾醇和胆固醇同属甾醇类，都是以环戊烷全氢菲为骨架的一种醇类化合物
7、，在结构上极其相似，植物甾醇与胆固醇的不同之处在于其支链上的双键和甲基 1。植物甾醇较胆固醇支链更长，有更强的疏水性 2，可降低人体对胆固醇的吸收。胆固醇是脂质体等药物输送体系的重要组成部分，可嵌入磷脂双分子层，调节磷脂膜的稳定性。随着现代人健康生活意识的不断提高，胆固醇的应用对于一些高血脂人群受到限制，为此学界开始植物甾醇取代胆固醇制备脂质体的研究。Marie 等 3发现植物甾醇可以降低大豆磷脂膜的通透性；杨贝贝 4的研究也表明混合植物甾醇对脂质体形成、膜的稳定性、包埋力作用比胆固醇要大。且植物甾醇在人体内吸收率较低 5，过量摄入也不会对人体造成危害，已被证实是一种绿色安全的降胆固醇药物，其
8、取代胆固醇制备脂质体是国内外研究热点。脂质体是由磷脂分散在水中形成的封闭囊泡结构，是优良的药物运输载体，可用于包埋亲水性和疏水性活性成分，具有靶向、缓释、降低毒性和提高药物稳定性等作用。但其自身稳定性易受外界环收稿日期：2017-12-18作者简介：程铭，男，1993 年出生，硕士，食品资源开发与利用通信作者: 王春维，男，1958 年出生，教授，粮油、食品、饲料资源开发境如 pH、温度、离子强度等影响。壳聚糖是一种天然的高分子生物材料，其在酸性溶液中呈现阳离子性质，可通过静电相互作用与带负电的脂质体结合，在脂质体表面形成一层保护膜；此外疏水相互作用、氢键、范德华力等多种相互作用力的存在使壳聚
9、糖修饰脂质体的结构变得更加丰富而复杂 6。刘玮琳等 7发现以壳聚糖修饰的脂质体比未修饰的脂质体稳定，且高浓度壳聚糖修饰脂质体稳定性更好。帅武平等 8考察了不同相对分子量的壳聚糖对脂质体性质的影响，得到较高相对分子质量壳聚糖修饰的脂质体具有更好的稳定性和抗血清能力，同时其细胞毒性要小于阳离子脂质体。严佳蕾等 9研究了不同浓度壳聚糖修饰脂质体对包载姜黄素的效果，发现 0.4%的壳聚糖对姜黄素脂质体保护效果最佳。壳聚糖修饰脂质体对于提高体系稳定性，降低药物的泄漏率具有重要意义，但目前对植物甾醇脂质体的研究较少，壳聚糖修饰植物甾醇脂质体的研究亦未见报道。本实验首先通过乙醇注入法制备植物甾醇脂质体，并以
10、不同浓度壳聚糖对其进行修饰、优化配比。考察了 pH、温度、离子强度等对 CS-PLs 稳定性的影响，并通过模拟人体胃肠环境探究了脂质体的消化稳定性。1 材料与方法1.1 材料与试剂植物甾醇（95%）：武汉远成共创科技有限公司；大豆卵磷脂（70%） 、壳聚糖（脱乙酰度95% ）：aladdin 试剂公司；胃蛋白酶、胰酶：Sigma-Aldrich 公司；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、胆盐等试剂均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。1.2 仪器与设备AL204 分析天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；T18 高速分散机：IKA 公
11、司；R-3 旋转蒸发仪：瑞士 Buchi 公司；pH计：上海奥豪斯仪器有限公司；Nano-ZS 粒度仪：英国 Malvern 公司；Turbiscan Lab 稳定性分析仪：法国 Formulaction 公司；JEM-2100 透射电镜：日本电子株式会社。1.3 方法1.3.1 CS-PLs 的制备1.3.1.1 PLs 的制备采用乙醇注入法 10制备 PLs，将大豆卵磷脂与植物甾醇按 4:1 的比例溶于无水乙醇中，使磷脂浓度为 40mg/mL，超声溶解。在高速分散（ 10000r/min）条件下，按有机相与水相比例为 1:5，将卵磷脂植物甾醇混合液缓慢注入水中，继续分散 2min，旋转蒸发
12、去除乙醇，加水稀释至原水相含量，得到 PLs。1.3.1.2 CS-PLs 的制备壳聚糖溶液的制备：称取 0.2g 壳聚糖粉末溶于 100mL1%乙酸水溶液中， 40水浴搅拌溶解，过滤除去不溶物，置于 4冰箱中水化过夜，取出后稀释备用。分别将 PLs 加入等体积不同浓度的壳聚糖溶液中，调节 pH 至 3.5，在 10000r/min 下高速分散2min，得到 CS-PLs。1.3.2 CS-PLs 理化性质表征1.3.2.1 粒径与 Zata 电位测定样品用去离子水稀释至一定浓度后，采用动态光散射技术测定植物甾醇脂质体平均粒径、多分散系数（Polydispersity index，PdI）和
13、Zeta 电位。1.3.2.2 CS-PLs 稳定性分析采用多重光散射技术（扫描波长 880nm） ，分析不同环境下脂质体的稳定性。将制备好的样品振荡摇匀，倒入样品池中，测定脂质体的稳定性指数 TSI（Turbiscan Stability Index） 。测试样品加入量为 1520mL，测定温度为 25，测定时间为 1h，扫描间隔为 25s。1.3.2.3 CS-PLs 形态观察取制备好的 CS-PLs 样品 1mL，用去离子水稀释至磷脂浓度为 0.8mg/mL，滴至专用铜网上，滤纸吸干多余脂质体；用 3%磷钨酸进行负染色，并用滤纸轻轻吸干多余染液，自然挥干，透射电镜下观察脂质体微观结构。1
14、.3.3 CS-PLs 体外消化稳定性1.3.3.1 消化液配制参照 Liu 等 11报道的模拟胃肠消化液的配制方法并加以改进。胃液储备液（Simulated gastric fluid, SGF）的配制：取 2gNaCl 溶于 800mL 去离子水中，用 0.1mol/LHCl 调节其 pH 至 2.0，定容至1L， 4 储藏备用。肠液储备液（ Simulated intestinal fluid, SIF）的配制：取 6.8gKH2PO4 溶于 800mL去离子水中，用 0.1mol/LNaOH 调节 pH 至 7.0，定容至 1L，4 储藏备用。胃蛋白酶和胰酶分别用胃肠储备液溶解，300
15、0r/min 离心取上清液。1.3.3.2 体外模拟胃肠消化胃消化：将 10mL 脂质体与 9mLSGF 混合于 50mL 离心管，调节 pH 至 2.0，在 37恒温水浴摇床上，以 95r/min 转速平衡 10min，加入 1mL 胃蛋白酶（80mg/mL ） ，开始消化。肠消化：将胆盐溶于 SIF（20mg/mL）中，搅拌溶解。取 10mL 脂质体与 9mlSIF 胆盐混合液于50mL 调节 pH 至 7.0，在 37恒温水浴摇床上，以 95r/min 转速平衡 10min，加入 1mL 胰酶（160mg/mL） ，开始消化。分别在 15、30、60、120、180min 取样测定消化后
16、脂质体粒径、电位大小。2 结果与分析2.1 不同浓度壳聚糖修饰 PLs 的制备以不同浓度的壳聚糖溶液修饰 PLs，所得 CS-PLs 中壳聚糖浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8mg/mL 。如表 1 所示，当 pH 为 3.5 时，低浓度的壳聚糖对脂质体粒径和 PdI 影响较小；当壳聚糖浓度达到 0.3mg/mL 以上时，脂质体中会出现较大颗粒，且多分散性变差。未添加壳聚糖脂质体粒径较小，由于磷脂带负电，脂质体也呈负电位。而壳聚糖表面带正电荷，随着壳聚糖的加入，壳聚糖吸附在磷脂膜上，使脂质体电位由负转正，且壳聚糖浓度越高，脂质体电位越大。当壳聚糖浓度达到 0.3mg/
17、mL 时，壳聚糖吸附达到饱和，继续提高壳聚糖浓度会增加脂质体修饰层厚度，导致粒径增加，而电位变化不显著。因此，选择 0.3mg/mL 壳聚糖为最佳浓度修饰PLs，分析 CS-PLs 的稳定性影响因素。表 1 不同浓度壳聚糖修饰 LPs 的平均粒径、PdI 和 Zeta 电位壳聚糖浓度/mg/mL 平均粒径/nm PdI Zeta 电位/mv0 77.634.34 0.2810.007 -33.50.90.1 75.670.69 0.2260.012 40.52.060.2 73.850.95 0.2420.009 51.41.230.3 76.760.24 0.240.018 60.51.03
18、0.4 80.176.79 0.3630.017 62.30.590.6 95.251.55 0.4020.02 65.91.160.8 103.553.19 0.4350.007 671.78由图 1 可知，通过激光粒度仪测定乙醇注入法制备的 PLs 粒径为 70.4nm，PdI 为 0.377，粒径分布范围广，并有较多大颗粒存在。经 0.3mg/mL 壳聚糖修饰后，脂质体粒径虽有所增加，达到76.73nm，但 PdI 降低到 0.246，且粒径分布更集中，大颗粒较少。CS-PLs 的透射电镜测定结果如图2，脂质体呈规则圆球状，粒径为 6070nm，较激光粒度仪测定结果偏小，这可能是由于透射
19、电镜样品制片时脱水而引起 12。0.110102468102/%/nm CS-PLs图 1 壳聚糖修饰前后 LPs 粒径分布图 2 CS-PLs 透射电镜图2.2 CS-PLs 稳定性影响因素电位是评定脂质体稳定性的重要指标之一，脂质体表面所带电荷越高，颗粒间静电斥力越大，脂质体越稳定。除此之外空间位阻、颗粒尺寸和流变性等也常用于评价脂质体的稳定性。稳定性分析仪通过检测样品在静置过程中粒子的迁移，可较真实地反应脂质体的稳定性变化；TSI越小，反应乳液体系越稳定。杭锋等 13通过测定不同温度下超高温灭菌乳的TSI，构建了乳品货架期加速试验数学模型，并预测了超高温灭菌乳的货架期。黄波等 14以TS
20、I为指标，优化了微乳液超声条件。本文以脂质体的粒径、电位为主要指标，并通过测定其TSI值，综合评价了脂质体在不同环境下的稳定性。2.2.1 pH 对 CS-PLs 稳定性影响新鲜制备的 PLs，加入壳聚糖后，分别调节 pH 至 2.0、3.0、4.0 、5.0、6.0、7.0，经高速分散后，测定 CS-PLs 稳定性。用相应 pH 的去离子水稀释脂质体，测定其粒径与电位。0102030405060024681012/TSI /min 2.03 4.50 6.7图 3 pH 对 CS-PLs 稳定性指数影响表 2 pH 对 CS-PLs 稳定性影响pH 平均粒径/nm PdI Zeta 电位/m
21、v 物理稳定性2.0 78.181.76 0.2710.021 43.61.27 稳定3.0 78.350.43 0.2520.005 60.40.44 稳定4.0 85.961.06 0.2930.022 57.71.76 稳定5.0 133.873.78 0.8930.029 39.90.87 稳定6.0 3193.67419.00 0.8690.163 23.80.50 分层7.0 2709.631586.83 0.9640.062 15.20.31 分层如表2所示，当pH为24时，CS-PLs粒径均在100nm以下，并表现出良好的分散性；当 pH5时，CS-PLs粒径开始增大，且多分散
22、性也开始变差。由图3可知，随着 pH增大，CS-PLs 稳定性反而增强，当pH达到6时，CS-PLs大量聚集，出现沉淀，其TSI均在10以上。与 Sonvico15的研究结果相似，即当pH从2.5增加到5时，卵磷脂-壳聚糖纳米粒的粒径和电位变化较小，当pH大于5时，纳米粒电位显著下降，且出现聚集。Liu 16等以卵磷脂-壳聚糖纳米粒包载胰岛素，发现当pH 由2增加到5.5时，纳米粒粒径和胰岛素包埋率逐渐增加，当pH为6时则出现沉淀。分析其主要原因可能是由于壳聚糖的等电点为6.5左右，当pH接近6时， CS-PLs表面弱的静电相互作用不足以维持结构稳定，颗粒开始聚集，并出现沉淀。2.2.2 温度
23、对 CS-PLs 稳定性影响新鲜制备的 CS-PLs，用稳定性分析仪分别在 25、30、40、50、 60下测定稳定性，每个样品扫描时间为 12h，扫描间隔 10min，取出样品后测定脂质体粒径与电位。06128403628540672234/TSI/min 253046图 4 温度对 CS-PLs 稳定性指数影响表 3 温度对脂质体稳定性影响温度/ 平均粒径/nm PdI Zeta 电位/mv 物理稳定性25 76.411.01 0.2480.005 68.31.46 稳定30 81.640.12 0.2830.024 58.50.99 稳定40 87.122.02 0.3430.003 6
24、4.71.60 稳定50 90.600.62 0.3550.016 60.81.50 稳定60 97.491.33 0.360.005 62.63.02 稳定温度是影响脂质体稳定性的重要因素之一。如表 3 所示，随着温度的升高，CS-PLs 粒径逐渐增大，多分散性变差，但其电位、外观无显著变化。由图 4 可见，在常温环境下，CS-PLs 的 TSI 仍在1 以下，稳定性良好；经加热后，CS-PLs 的 TSI 迅速上升，其主要是由于在加热条件下，脂质体分子运动更加剧烈，加速了磷脂分子层的水解与氧化，结构破坏 17。而约 2h 后，TSI 又呈现缓慢下降趋势，其可能是壳聚糖充分溶胀，重新自组装成
25、稳定颗粒，提高了 CS-PLs 稳定性。2.2.3 离子强度对 CS-PLs 稳定性影响新鲜制备的 CS-PLs，分别加入 10、25、50、100、150、200mmol/L 的 NaCl 和 CaCl2，调节脂质体的离子强度，37水浴搅拌 10min，通过稳定分析仪测定脂质体的稳定性。并分别用对应浓度的 NaCl 和 CaCl2 溶液稀释脂质体，测定其粒径和电位。0102030405060024681012/TSI /min 10mol/L 25l 0ol/L 1ml 50ol/L 2l图 5 NaCl 浓度对 CS-PLs 稳定性指数影响表 4 NaCl 浓度对 CS-PLs 稳定性影响
26、NaCl 浓度/mmol/L 平均粒径/nm PdI Zeta 电位/mv 物理稳定性10 87.140.52 0.3070.03 41.20.98 稳定25 197.557.69 0.5780.02 37.91.93 分层50 1358.6759.97 0.6080.15 29.60.55 分层100 1361.67245.49 0.7200.49 24.50.78 分层150 1241.03440.11 0.6770.06 20.20.80 分层200 1786.24841.12 0.9640.062 19.00.87 分层如表 4 所示，NaCl 浓度对 CS-PLs 稳定性有显著影响，
27、当浓度为 10mmol/L 时，脂质体粒径为87.14nm，多分散性较好；随着 NaCl 浓度的加大，盐离子的存在会屏蔽脂质体表面电荷，使脂质体电位逐渐降低，粒径显著增大，稳定性变差。曹金娜 18等也发现当 NaCl 浓度大于 20mmol/L 时，脂质体稳定性较差。如图 5 所示，稳定性分析也表现出相似结果。对于阴离子脂质体，Ca 2+可以在脂质体之间形成“盐桥“，增加磷脂膜疏水性，导致脂质体的失稳 19。经壳聚糖修饰后，CS-PLs表面带正电荷，加入Ca 2+并未引起脂质体的聚集。如表5所示，CS-PLs对 CaCl2表现出较好的耐受性，即使在200mmol/LCaCl 2的环境下也能维持
28、稳定。盐离子的存在也会影响脂质体表面电荷，随着离子强度的增加，脂质体电位逐渐降低。如图6所示，稳定性分析显示，不同离子强度下，CS-PLs的TSI均在1以下，当CaCl 2浓度为100mmol/L时，脂质体的TSI最小为0.4，比未添加Ca 2+的脂质体表现出更好的稳定性，其可能原因是由于金属离子的作用使酰基链的排列更加紧密，降低了磷脂膜的流动性，从而提高CS-PLs稳定性 20。01020304050600.0.20.40.60.81.0/TSI/min10mol/L25l l/10olL 5ml/2l图,6 CaCl2 浓度对 CS-PLs 稳定性指数影响表 5 CaCl2 浓度对脂质体稳
29、定性影响CaCl2 浓度/mmol/L 平均粒径/nm PdI Zeta 电位/mv 物理稳定性10 106.8313.76 0.3730.06 38.072.29 稳定25 100.1010.96 0.4400.08 25.570.74 稳定50 92.079.93 0.3760.06 22.102.42 稳定100 102.6317.46 0.3800.13 19.430.68 稳定150 102.174.10 0.4930.09 18.401.25 稳定200 116.8127.91 0.3980.04 17.371.55 稳定2.3 CS-PLs 体外消化稳定性由图 7 可知，在模拟胃
30、环境中，PLs 与 CS-PLs 随着消化时间的延长，粒径均略有增加，经 3h消化后，其平均粒径大小均能维持在 120nm 以下，说明两种脂质体在酸性环境均能保持良好的稳定性。由于加入的胃蛋白酶对脂质体没有影响，故测得模拟胃液中两种脂质体在不同消化时间段电位无显著差别。在强酸性环境下，PLs 所带负电荷被中和，电位增加为 -10mv 左右，而 CS-LS 自身带正电荷，大量 H+的存在屏蔽了壳聚糖表面所带电荷，电位下降到 30mv。024680124601829510152/nm/min PLsCS-510253/v图 7 模拟胃消化环境下脂质体粒径、电位变化02468012460182530
31、450/nm/min PLsCS-5-2305-4/v图 8 模拟肠消化环境下脂质体粒径、电位变化在模拟肠液中，因加入的胰酶中含有一定量的胰脂肪酶，可水解脂质体中的磷脂，破坏了脂质体的结构。如图 8 所示，PLs 在模拟肠液中，粒径先增大，然后逐渐降低，磷脂分子层的破坏造成脂质体粒径增大，而肠液中含有大量胆盐，在 37条件下，大的颗粒会重新自组装成微胶束，粒径减小。Liu 21等以大豆磷脂和牛奶磷脂制备脂质体，在体外肠消化过程中也得到了相似的结果。PLs经壳聚糖修饰后，脂质体表面包裹了一层保护壳，降低了脂质体与胰脂肪酶的接触机会，从而可有效减轻脂质体的破坏程度 22。由上述结果可知，CS-PL
32、s 在中性环境中稳定性较差，在模拟肠液环境中会形成沉淀物，但消化 15min 后，混合物粒径也逐渐降低，且较 PLs 具有更小的粒径。3 结论本研究通过粒径、电位等的测定，确定了壳聚糖修饰 PLs 的最佳浓度为 0.3mg/mL；且发现pH、温度、盐粒子种类及其浓度均对 CS-PLs 稳定性影响较大；所以选择适宜的制备工艺和储藏条件对维持脂质体稳定具有重要意义。在模拟胃环境中壳聚糖修饰前后 PLs 均表现出良好的稳定性，而模拟肠环境中，经修饰后的 PLs 粒径更小更稳定。本研究对 CS-PLs 在不同条件下的稳定性进行了探讨，为 CS-PLs 的进一步研究和应用提供一些理论依据。参考文献1 寇
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