1、TEL:021-60514606 Web:www.sh- Catalog #:95124大鼠肿瘤蛋白p53(TP53)检测试剂盒 使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 96T78.13-5000pg/mL灵敏度：30pg/mL使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清样本大鼠肿瘤蛋白 p53(TP53）含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠肿瘤蛋白 p53(TP53）水平。用纯化的大鼠肿瘤蛋白 p53(TP53）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤蛋白p53(TP53，再与 HRP 标记的肿瘤蛋白 p53(TP53）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，
2、经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肿瘤蛋白 p53(TP53）呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），通过标准曲线计算样品中大鼠肿瘤蛋白p53(TP53）浓度。 试剂盒1 30 倍浓缩洗涤液 20ml1 瓶 7 终止液 6ml1 瓶2 酶标试剂 6ml1 瓶 8 标准品 5000pg/mL 0.5ml1 瓶3 酶标包被板 12 孔8 条 9 标准品稀释液 1.5ml1 瓶4 样品稀释液 6ml1 瓶 10 说明书 1 份5 显色剂 A 液 6ml1 瓶 11 封板膜 2 张
3、 6 显色剂 B 液 6ml1/瓶 12 密封袋 1 个标本要求 1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/ 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成应再次离心。尿液：用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，
4、用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。5.培养细胞:TEL:021-60514606 Web:www.sh- Catalog #:95124检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。6.组织标本:切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8的温度。加入一定量的 P
5、BS（PH7.4 ），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。7.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20保存，但应避免反复冻融8.不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。操作步骤1. 标准品：其浓度为 5000pg/mL(贮液) 。先将其稀释为 5000pg/mL 标准曲线最高浓度)后，再准备 5 个稀释标准品的 EP 管，每个 EP 管中加入 150L 的标准品稀释液，如图所示依
6、次倍比稀释 5000pg/mL，2500pg/mL，1250pg/mL，625pg/mL，312pg/mL，156pg/mL 品稀释液（0pg/ml）直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液Tube 0 1 2 3 4 5pg/mL 5000pg/mL 2500pg/mL 1250pg/mL 625pg/mL 312pg/mL 156pg/mL1 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50l，待测样品孔中先加样品稀释液 40l，然后再加待测样品 10l（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将
7、样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。1. 温育：用封板膜封板后置 37温育 30 分钟。 2. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用3. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。4. 加酶：每孔加入酶标试剂 50l，空白孔除外。 5. 温育：操作同 3。6. 洗涤：操作同 5。7. 显色：每孔先加入显色剂 A50l，再加入显色剂 B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色10 分钟.8. 终止：每孔加终止液 50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。9. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光
8、度（OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。TEL:021-60514606 Web:www.sh- Catalog #:95124操作程序总结：计算以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 注意事项1试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴
9、中加温助溶，洗涤时不影响结果。3各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（n5）。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6底物请避光保存。TEL:021-60514606 Web:www.sh- Catalog #:951247严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9本试剂不同批号组分不得混用。保存条件及有效期1试剂盒保存：；2-8。2有效期：6 个月
