1、卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型心脏保护作用研究董世芬 1，洪缨 1，靳洪涛 2，孙建宁 1*（1. 北京中医药大学中药学院，北京 100102；2. 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所新药安全评价研究中心，北京 100050）【摘要】 目的 研究卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病（T2DC）模型动物心脏保护作用和可能机制。方法 以高糖脂饲料负荷 30 mg/kg 剂量链脲佐菌素一次性腹腔注射建立 T2DC 大鼠模型，观察卡托普利 45 mg/kg 灌胃给药 6 周对模型动物血糖和血脂水平，心脏功能和结构变化，心肌脂肪酸含量以及心肌组织过氧化物增殖体激活受体 （PPAR ）和
2、葡萄糖转运体 4（GLUT4）基因表达等指标的影响。结果 与 T2DC 大鼠模型比较，卡托普利给药后，左心室收缩压、左心室最大收缩速率、左心室最大舒张速率的绝对值和心输出量分别显著增加 15%、77%、52%和 54%（P 0.05 或 P 0.01）；室间隔厚度降低40%（P 0.001） ；血浆糖化血红蛋白和心肌组织游离脂肪酸含量分别降低 31%和 24%（P 0.01，P 0.05） ；心肌组织 PPAR 基因表达显著降低（P 0.05） ，GLUT4 基因表达显著增加（P 0.05） 。结论 卡托普利可以显著改善 T2DC 模型动物心脏功能、抑制心室重构，其作用机理可能同调节与能量代谢
3、相关基因表达、减轻心脏内脂肪积聚有关。【关键词】2 型糖尿病心肌病；卡托普利；心脏功能；心脏结构；能量代谢【中图分类号】 R-332Protective effects of captopril on cardiac function and structure in experimental type 2 diabetic cardiomyopathy rat modelDONG Shi-fen1, HONG Ying1, JIN Hong-tao2, SUN Jian-ning1*(1. School of Chinese Materia Medica, Beijing Universit
4、y of Chinese Medicine，Beijing 100102, China; 2. Department of Evaluation of Drug Safety, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences Captopril; Cardiac function; Cardiac structure; Energy metabolism卡托普利（captopril，Cap）作为血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI） ，常
5、用于高血压和充血性心力衰竭的治疗 1，在治疗高血压时显示出防止和逆转心肌重塑等优势。动物研究证实卡托普利还可以改善 C57BL/6J-lepob（ob/ob）肥胖小鼠的心肌能量代谢异常 2，抑制钙激活中性蛋白酶导致的心脏功能异常和心肌细胞凋亡 3，并可通过抑制肾组织葡萄糖沉积 4,5、减轻肾脏纤维化过程 6等改善糖尿病肾病。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DC ）是糖尿病心脏病的一种特异性病变 7，以发病早期出现左心室重量增加和心肌纤维化异常为特点 8。肾素-血管紧张素- 醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAA
6、S）的激活在 DC 早期左心室肥厚的发生以及疾病发展过程中有重要的作用 9。本研究采用高热量饮食负荷化学因素建立 2 型糖尿病心肌病（type 2 diabetic cardiomyopathy，T2DC）大鼠模型，观察卡托普利对模型动物心脏功能和心脏结构变化的影响，并从血糖、血脂和心肌组织脂肪酸变化，以及与能量代谢相关基因表达等方面探讨卡托普利对糖尿病心肌病的可能作用机制。1. 材料和方法1.1 实验动物 SPF 级 Wistar 雄性大鼠，来源于北京维通利华实验动物技术有限公司 【SCXK（京）2007-0001】 ，体质量（18020 ）g。于室温 2225，相对湿度 65%，12 h
7、明暗交替环境中适应 7 d 后进入实验。1.2 药品与试剂 高糖脂饲料（20%蔗糖+10% 猪油+2.5%胆固醇+1% 胆盐+66.5%基础饲料粉） ，来源于北京科澳协力饲料有限公司【SCXK（京）2005-0007 】 ；链脲佐菌素（ streptozotocin，STZ）和卡托普利（captopril，Cap）由 Sigma 公司提供，批号分别为 38K152 和 77K1623。葡萄糖、糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA 1c） 、总胆固醇（total cholesterol，TC ） 、甘油三酯（triglyceride ，TG） 、游离脂肪酸（non
8、-esterified fatty acids，NEFA）和肌酸激酶（creatine kinase， CK）生化测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，批号20090601。主要 real-time PCR 试剂：TRIzol 试剂，无 RNA 酶的水，无 RNA 酶的糖原，10000 Sybergreen，Invitrogen life technologies 提供，美国；RNA 酶抑制剂，MMLV 反转录酶，10 RT 缓冲液（250 mM Tris-HCl，pH 8.3，200 mM KCl，40 mM MgCl2，5 mM DTT） ，Epicentre biotechnologi
9、es 提供，美国；2.5 mM dNTP 混合液（dATP，dGTP，dCTP 和dTTP 各 2.5mM） ，HyTest Ltd. 提供，美国；Taq 聚合酶， Promega 提供；Random 9，上海生工生物工程有限公司提供；100 bp DNA Ladder，天根生化科技（北京）有限公司提供。过氧化物增殖体激活受体 （ peroxisome proliferator activated receptor-, PPAR ）引物信息为 5ATTTGCCAAGGCTATCCCA3（正向） ，5CAGCATCCCGTCTTTGTTCA3 （反向） ，葡萄糖转运体-4（glucose tra
10、nsporter-4，GLUT4 ）引物信息为5TCCTTTCCTCGCAGCACTT3（正向）和 5CCACAGCCTAGCCACAACAC3（反向） ，甘油三磷酸脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH ）引物信息为5GGAAAGCTGTGGCGTGAT3（正向）和 5AAGGTGGAAGAATGGGAGTT3（反向） 。 1.3 主要实验仪器 紫外分光光度计：AGILENT 8453，Agilent Techologies，德国；Biopac System MP150， Biopac System Inc.，美国；Gene Amp
11、PCR System 9700，Applied Biosystems，美国；TaKaRa PCR Thermal Cycler，大连宝生物工程有限公司； DYY-8 型稳压稳流电泳仪，上海琪特分析仪器有限公司提供；H6-1 微型电泳槽，上海精益有机玻璃制品仪器厂提供；Rotor-Gene 3000 Real-time PCR 仪，Corbett Research 提供，澳大利亚；引物设计软件：Primer 5.0，Rotor-gene 6.0，Corbett Research 提供，澳大利亚。 1.4 实验方法1.4.1 实验动物分组与处理 Wistar 大鼠 45 只，按体重随机取 15 只
12、作为正常对照组（control） ，常规饲养；另外 30只大鼠喂饲高糖脂饲料，每 2 周监测血脂水平，确认血脂明显升高后（约 6 周） ，按照 30 mg/kg 剂量一次性腹腔注射（i.p.）STZ（以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释， pH 4.5，4配制，随配随用） ，control 大鼠 i.p.同体积柠檬酸 -柠檬酸钠缓冲液。72 h 后，测定血糖，以禁食12 h 血糖 7.8 mmol/L 为是糖尿病模型成功标准，24 只动物血糖合格，按血糖水平随机分为 2 型糖尿病心肌病模型组（T2DC） 、卡托普利 45 mg/kg 治疗组（T2DC+Cap） ，每组 12只。药物以 0.5% 羧甲基
13、纤维素钠（CMC-Na ）混悬，灌胃给药开始于注射 STZ 72 h 后，给药容量为 1 ml/100 g 体重，每日一次。Control 组和 T2DC 模型组给相应体积 0.5% CMC-Na 混悬液，共给药 6 周。给药期间，control 组继续常规饲养，其余 2 组同前给高糖脂饲料，自由进水，直至实验结束（共 12 周） 。1.4.2 心功能测定 容积阻抗法测定心输出量：给药结束后（第 13 周） ，大鼠禁食 12 h，称重，按照 35 mg/kg 剂量 i.p.戊巴比妥钠溶液麻醉，仰位固定。将 Biopac System MP150 生物采集器的心电图和心排量针式电极按照说明插入大
14、鼠四肢皮下，固定阻抗电极间距离，将听诊器固定于大鼠心脏二尖瓣搏动最强处，实时采集心电图、容积阻抗图和心音图，测心率和每搏输出量，计算得到心输出量（cardiac output ，CO） 。左心室插管法测定左心室血流动力学指标：心输出量测定完毕，分离右颈总动脉，将20G 静脉留置针经颈总动脉插管至左心室，采集左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP） 、左心室舒张末期压力（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）和左心室最大收缩/舒张速率（ the maximum rate of myocar
15、dial contraction and the maximum rate of myocardial diastole，dp/dt max） 。1.4.3 左心室前壁和室间隔厚度测量 沿大鼠心脏左心室赤道面横切，取适量心肌组织，加 10 倍量福尔马林固定，石蜡包埋，切片（厚度 4 m） ，常规 HE 染色。显微镜下观察左心室形态，用 Image-ProPlus 5.0 专业图像分析软件测定左心室前壁厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）和室间隔厚度（interventricular septal thickness，IST） 。每组 3 只动物，每只
16、动物观察 2 张切片，取平均值。1.4.4 生化法测定血糖、血脂和心肌组织游离脂肪酸 心脏功能测定完毕，颈总动脉取空腹血（肝素抗凝） ，3000 r/min，离心 15 min，分离血浆，按试剂盒说明测定空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG） 、HbA 1c、TC 和 TG。留取适量同部位心脏组织，预冷生理盐水充分洗净，加生理盐水冰上制作 10%匀浆，3500 r/min，离心 10 min，留取上清，生化法测定心肌组织 NEFA。1.4.5 实时定量 PCR 法测定心肌组织 PPAR 和 GLUT4 mRNA 表达取适量大鼠左心室组织心尖部分，液氮速冻，-80 储存
17、备用。按试剂盒要求，TRIzol法抽提总 RNA，转录合成 cDNA。合成的 cDNA 用于实时定量 PCR 反应，反应条件为GAPDH：95，5min；35 个 PCR 循环（95 ，10 秒；59，15 秒；72，20 秒；84（收集荧光） ，5 秒） ；PPAR ：95，5 min；40 个 PCR 循环（95，10 秒；59，15 秒；72，20 秒； 81（收集荧光） ，5 秒） ；GLUT4：95，5 min；40 个 PCR 循环（95，10 秒；59， 15 秒；72 ， 20 秒；85（收集荧光） ，5 秒） ；为了建立 PCR 产物的熔解曲线，扩增反应结束后继续从 72缓慢
18、加热到 99（每 5 秒升高 1） 。各样品的目的基因和管家基因分别进行 real-time PCR 反应。根据绘制的梯度稀释 DNA 标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。1.4.6 统计学处理 实验数据结果采用 表示，用 SPSS11.0 统计软件分析比较。两组组间、组内比较sx用 t 检验；多组比较用单因素方差分析（ One-way ANOVA，LSD 法） 。2. 结果2.1 卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型血糖、血脂生化指标的影响如表 1 所示，与正常对照大鼠比较，实验性
19、 2 型糖尿病心肌病大鼠模型（T2DC）的血糖（FPG 、HbA 1c）和血脂（TG、TC）指标均显著增加（P 0.01 或 P 0.001） 。卡托普利 45 mg/kg 灌胃给药 6 周，仅出现对 HbA1c 增高的抑制作用，与 T2DC 组比较，T2DC+Cap 组 HbA1c 值显著降低 31%（P 0.01） ，FPG 、TC 和 TG 指标有下降趋势，但未通过统计学检验。表 1 卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型血糖、血脂生化指标的影响 ( s, xn=12)Table. 1 Effects of captopril on plasma sugar and lipid l
20、evels in experimental type 2 diabetic cardiomyopathy rat model ( s, n=12)x组别Groups空腹血糖FPG（mmol/L）糖化血红蛋白HbA1c（A/10 g Prot）总胆固醇TC(mmol/L)甘油三酯TG (mmol/L)正常对照组Control 3.60.3* 267* 1.70.2* 0.80.3*2 型糖尿病心肌病模型组T2DC 18.85.6 4515 5.22.6 1.30.7卡托普利组T2DC+Cap 14.08.0 318* 4.01.8 1.10.6注：与 2 型糖尿病心肌病模型组比较， * P 0.
21、01, * P 0.001Note: Compared with the T2DC group, * P 0.01, * P 0.0012.2 卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型心功能的影响如表 2 所示，T2DC 大鼠模型心脏出现收缩和舒张功能损伤，与 control 大鼠比较，LVSP、 +dp/dtmax 以及 LVEDP 和-dp/d tmax 的绝对值均显著下降（P 0.01，P 0.05，P 0.001，P 0.01），同时 CO 显著降低 36%（P 0.05）；与 T2DC 大鼠模型比较，T2DC+Cap 组动物 LVSP、+dp/d tmax 水平以及-dp/dt
22、max 绝对值分别升高 15%、77%和52%（P 0.05 或 P 0.01）， CO 值增加 54%（P 0.05） 。表 2 卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型心功能的影响 ( s, n=12)xTable. 2 Effects of captopril on cardiac function in experimental type 2 diabetic cardiomyopathy rat model ( s, n=12)x组别Groups左心室收缩压LVSP(mmHg)左心室舒张末期压力绝对值LVEDP(mmHg)左心室最大收缩速率+dp/dt max(mmHg/s)左心
23、室最大舒张速率绝对值-dp/dt max(mmHg/s)心输出量CO (mL/min)正常对照组Control 15018* 11.66.8* 111902285* 87781698* 154*2 型糖尿病心肌病模型组T2DC12316 6.42.0 61301633 54781755 93卡托普利组 14212* 6.41.7 108742898* 83682518* 157*T2DC+Cap注：与 2 型糖尿病心肌病模型组比较， * P 0.05, * P 0.01, * P 0.001Note: Compared with the T2DC group, * P 0.05, * P 0.
24、01, * P 0.0012.3 卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型心脏结构的影响如表 3 所示，与 control 大鼠比较，T2DC 大鼠 IST 和 LVWT 显著增加（P 0.001 和 P 0.05） ，心室壁肥厚出现。Captopril 治疗后，模型动物 IST 显著降低 40%（P 0.001） ；同时 LVWT 降低 6%，但未见明显差异。表 3 卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型心脏结构的影响( s, n=12)xTable. 3 Effects of captopril on interventricular septal thickness and l
25、eft ventricular wall thickness in experimental type 2 diabetic cardiomyopathy rat model ( s, n=12)组别Groups心室间隔厚度IST (mm)左心室前壁厚度LVWT (mm)正常对照组Control 1.040.11* 2.300.42*2 型糖尿病心肌病模型组T2DC 1.860.14 3.061.11卡托普利组T2DC+Cap 1.100.46* 2.860.56注：与 2 型糖尿病心肌病模型组比较， * P 0.05, * P 0.001Note: Compared with the T2D
26、C group, * P 0.05, * P 0.0012.4 卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型心肌组织游离脂肪酸和肌酸激酶的影响如表 4 所示，与 control 比较，T2DC 大鼠模型心肌组织游离脂肪酸和肌酸激酶含量明显增加（P 0.001） ；与 T2DC 组比较，T2DC+Cap 组大鼠心肌组织 NEFA 和 CK 值分别降低 24%和 18%（P 0.05） 。表 4 卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型心肌组织游离脂肪酸和肌酸激酶的影响(s, n=12)xTable. 4 Effects of captopril on myocardial non-ester
27、ified fatty acids and creatinekinase concentration in experimental type 2 diabetic cardiomyopathy rat model ( s, n=12)x组别Groups心肌组织游离脂肪酸myo-NEFA(mol/g Prot)心肌组织肌酸激酶myo-CK (U/mg Prot)正常对照组Control 5918* 0.600.19*2 型糖尿病心肌病模型组T2DC 10018 1.170.16卡托普利组T2DC+Cap 7622* 0.950.20*注：与 2 型糖尿病心肌病模型组比较， * P 0.05,
28、* P 0.001Note: Compared with the T2DC group, * P 0.05, * P 0.0012.5 卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型心肌组织 PPAR 和 GLUT4 基因表达的影响以 GAPDH 作内参，用 real-timePCR 技术分别检测检测了 PPAR 和 GLUT4 mRNA 的表达水平，结果发现心肌组织中 PPAR 和 GLUT4 mRNA 表达较强。结果分析显示，与control 组比较，T2DC 大鼠心肌组织 PPAR mRNA 表达显著升高（P 0.05） ，GLUT4 mRNA 水平明显降低（P 0.05） ；captop
29、ril 治疗后，与模型动物比较，T2DC+Cap 组 PPAR mRNA 表达量显著降低 38%（P 0.05） ，GLUT4 mRNA 显著增加 36%（P 0.05） 。表 5 卡托普利对实验性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型心肌组织 PPAR 和 GLUT4 mRNA 基因表达的影响( s, n=3)xTable.5 Effects of berberine on cardiac PPAR and GLUT4 gene expression in experimental type 2 diabetic cardiomyopathy rat model ( s, n=3)组别Groups过氧
30、化物增殖体激活受体/甘油三磷酸脱氢酶PPAR /GAPDH mRNAexpression葡萄糖转运体 4/甘油三磷酸脱氢酶GLUT4/GAPDHmRNA expression正常对照组Control 0.740.036* 0.720.12*2 型糖尿病心肌病模型组T2DC 1.330.16 0.470.10卡托普利组T2DC+Cap 0.830.068* 0.640.073*注：与 2 型糖尿病心肌病模型组比较， * P 0.05Note: Compared with the T2DC group, * P 0.053. 讨论卡托普利为 ACEI 制剂，临床研究结果认为 ACEI 制剂可保护胰
31、岛功能和预防糖尿病发生，特别是对葡萄糖耐受量受损的高血压病人治疗有优势 10,11。但是将卡托普利应用于2 型糖尿病患者治疗后，FPG 、胰岛素、NEFA 和 HbA1c 含量检测结果报道不一致。有研究显示卡托普利在降低 2 型糖尿病伴肥胖患者血压时，对以上指标并没有明显改变 12；也有研究发现多例高血压不伴有糖尿病患者使用 ACEI 后，胰岛素敏感性显著增加 13。RAAS与心血管系统功能密切相关，在心肌肥厚和间质纤维化发生中有重要意义。卡托普利是通过抑制 RAAS 发挥改善糖耐量和胰岛素敏感性作用的，但是机制复杂，一般认为与提高骨骼肌微循环和血流量，进而增加胰岛素敏感性组织的葡萄糖和胰岛素
32、的摄入，促进胰岛素信号途径作用和 细胞胰岛素分泌有关 14。实验研究提示卡托普利可以降低高脂饲料喂养的 D57BL/6J 小鼠体重，改善糖耐量，降低血浆 NEFA 含量 15。本研究结果显示，卡托普利对于负荷小剂量 STZ 和高热量饮食诱发的大鼠高血糖和高血脂，卡托普利仅显示出对模型动物糖化血红蛋白升高的抑制作用，对 FPG、TC 和 TG 值没有明显的作用。卡托普利对于糖尿病心血管损伤也显示出保护作用。ob/ob 肥胖小鼠心脏脂肪酸氧化增加，糖酵解降低，胰岛素调节心脏底物利用能力以及 Akt 磷酸化降低，卡托普利应用后可以通过提高 Akt 磷酸化，恢复胰岛素对心脏脂肪酸氧化和糖酵解能力，同时
33、抑制腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）磷酸化，改善心脏动力 16；卡托普利治疗对糖尿病自发性高血压大鼠和 STZ 诱导的糖尿病大鼠，可以降低平均收缩压、心重和左心室重量 17；对糖尿病 Wistar Kyoto 大鼠，卡托普利则可以降低其动脉压、左心室前壁厚度，并且抑制缓激肽生成 18。本研究结果显示卡托普利可以减轻心肌损伤，降低心肌组织肌酸激酶含量；改善 T2DC 模型大鼠心脏收缩和舒张功能，提高心输出量；同时可以改善心脏肥厚状态，降低 IST，对 LVWT 作用不明显。在探讨卡托普利对糖尿病心肌病保护作用机理时，已有研究证实其可以通过上
34、调 STZ诱导的糖尿病性心肌病大鼠脂肪酸 氧化相关基因、线粒体电子质子偶联合氧化磷酸化相关基因改善病变心肌的能量供应，对心肌组织起保护作用 19。PPAR 可通过增加心脏脂肪酸氧化率和降低葡萄糖代谢引发类似糖尿病心肌病变 20-23，PPAR 诱导大量基因参与脂肪分解过程，包括脂肪酸转运、酯化、连接和 -氧化过程，同时可减少多种参与葡萄糖代谢的基因如 GLUT4 和磷酸果糖激酶的水平，导致葡萄糖摄取和利用受损，心脏能量利用率下降 24；PPAR 也可能通过改变外周循环中内源性底物的浓度间接影响心脏的代谢 25。本研究结果证实 Wistar 大鼠以高糖高脂膳食负荷 STZ 诱导后，心肌组织 PP
35、AR 基因表达增加，GLUT4 mRNA 基因表达降低，这可能是造成模型大鼠心脏脂肪过度利用、积聚的基因转录作用机制。卡托普利则可以降低心肌组织 PPAR mRNA 基因表达，提高 GLUT4 mRNA 基因表达，降低糖尿病心肌病模型大鼠心肌组织游离脂肪酸含量，抑制心肌组织的脂肪积聚，减轻脂毒性，改善能量利用障碍，可能是其保护糖尿病心肌病心脏损伤的机制之一。综上所述，卡托普利可以改善高糖脂膳食负荷小剂量 STZ 造成的实验性糖尿病心肌病模型大鼠的心脏收缩功能和舒张功能，抑制心室间隔厚度增加，作用机制可能与抑制心肌组织 PPAR 基因，提高 GLUT4 基因表达，从而减轻心肌脂肪积聚有关。4 参
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