1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 功能化聚吡咯修饰电极对蛋白质电化学行为研究 所在学院 专业班级 环境工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 以固定在玻碳电极（ GCE） 上的多壁碳纳米管（ MWCNTs）为基底 ,利用循环伏安法对 含有 十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB） 和 吡咯单体的盐酸溶液进行电化学聚合，形成掺杂 CTAB的聚吡咯 (PPy)/MWCNTs修饰的玻碳电极（ CTAB-PPy/MWCNTs/GCE） 。再将辣根过氧化物酶（ HRP）固定于修饰电极上，研究蛋白质的直接电化学。 关键词 : 多壁碳纳米管 ；聚吡咯；辣根过氧化物酶；电聚
2、合；过氧化氢 II Abstract: Based on the Fixed multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) on glassy carbon electrode, Hydrochloric acid solution which conteined Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide（ CTAB） and pyrrole was electropolymerized by cyclic voltammetry method to form CTAB-doped PPy/MWCNTs modified GCE(
3、CTAB-PPy/MWCNTs/GCE).Then immobilized Horseradish Peroxidase (HRP) on the modified electrode, and finally investigated the direct electrochemistry of protein. Keywords: Multi-walled carbon nanotubes; polypyrrole; Horseradish Peroxidase; electropolymerization; H2O2目 录 摘要 . Abstract . 1 绪论 . 1 1.1 导电高
4、分子材料 . 1 1.2 聚吡咯 . 1 1.2.1 聚吡咯的性质 . 1 1.2.2 聚吡咯的制备方法 . 1 1.3 聚吡咯功能化 . 2 1.3.1 聚吡咯功能性单体共聚 . 2 1.3.2 与其他聚合物的复合 . 3 1.3.3 PPy/ 无机粒子 . 3 1.4 蛋白质直接电化学研究 . 4 1.4.1 生物膜和生物模拟膜电极构筑及蛋白质 /酶直接电化学 . 4 1.4.2 基于纳米粒子组装体系的蛋白质 /酶直接电化学 . 4 1.4.3 基于碳纳米管组装体的蛋白质 /酶直接电化学 . 4 1.5 辣根过氧化物酶 (HRP) . 5 1.6 本课题的意义 . 5 2 实验部分 . 6
5、 2.1 仪器和试剂 . 6 2.1.1 仪器 . 6 2.1.2 试剂 . 7 2.2 实验方法 . 7 2.2.1 多壁碳纳米管修饰玻碳电极（ MWCNTs/GCE）的制备 . 7 2.2 2 掺杂 CTAB的聚吡咯多壁碳纳米管修饰电极的制备 . 7 2.2.3 固定化 HRP于 CTAB-PPy/MWCNTs/GCE表面 . 7 3 实验结果与分析 . 8 3.1 多壁碳纳米管羧基功能化 . 8 3.2掺杂 CTAB的聚吡咯多壁碳纳米管修饰电极的制备 . 9 3.3 HRP-CTAB-PPy-MWCNTs 修饰 GCE对 H202的响应 . 10 4 结论 . 12 参考文献 . 错误
6、!未定义书签。 1 1 绪论 1.1 导电高分子材料 自从掺杂聚乙炔呈现金属导电特性以来，新型交叉研究领域 导电高分子诞生了。导电高分子材料可以分为结构型和复合型两大类。结构型导电高分子材料是高分子本身的结构具有一定的导电性能，或者经过一定的掺杂处理后具 有导电功能的材料，例如聚乙炔、聚苯胺等。复合型导电高分子材料是由高分子基质与具有导电性能的材料通过各种复合方法形成的导电材料，复合材料中聚合物本身没有导电性能，起导电作用的是聚合物中添加的导电物质，例如炭黑、金属粉等。结构型导电高分子材料是由具有共轭双键结构的高分子经化学或电化学掺杂，使其由绝缘体转变为导体或半导体的一类高分子材料，包括本征态
7、导电高分子材料和掺杂态导电高分子材料。导电高分子材料无需添加无机导电材料即可导电，且 电子的成键与反键能带之间能隙小（ Eg=1.5 4.2 eV），接近于无机半导体的导 带价带能隙。本征态导电高分子材料不仅由于发生P 型掺杂（失去电子）或 N 型掺杂（得到电子）而形成掺杂态导电高分子材料，而且具有分子结构可设计、原料来源广、易加工、密度小的特点，其室温电导率可在绝缘体 -半导体 -金属导体范围内变化。 1 1.2 聚吡咯 聚吡咯不仅具有优异的电性能和电化学性能，而且具有合成容易、价格低廉和环境友好等优势，被认为是一种具有广阔应用前景的电子导电高分子（ ECP）材料 2。 1.2.1 聚吡咯的
8、性质 聚吡咯由于具有典型的刚性共轭大键结构 (图 1) 而表现出良好的导电性 ,并且具有电 导率可调、易合成且质轻等诸多为金属导电材料所无法比拟的优点 ,在二次电池、防静电与电磁屏蔽、传感器、电致变色材料等多个领域具有广阔的应用前景 ,是导电高分子研发领域中最受关注的方向之一。 3 图 1 聚吡咯 (PPY) 的共轭大键结构 1.2.2 聚吡咯的制备方法 吡咯单体是一种 C,N五元杂环分子 ,室温下为无色油状液体 ,沸点 129. 8 ,密度 0. 97 g/cm3 .,微溶于水 ,无毒 ,在电场或氧化剂的作用下易被氧化 ,进而发生聚合反应生成高分子聚合物。目前 ,2 聚吡咯膜的制备主要有化学
9、氧化法和电化学氧化法两种 。通常 ,化学氧化法制备工艺简单易操作 ,成本较低 ,适于大批量生产 ,但得到的聚吡咯一般为粉末样品 ,加工成型困难 ;而电化学氧化法则可直接得到导电聚吡咯薄膜。 4 吡咯单体在 CH3CN /NaClO4 溶液中的半波氧化电势 +0.76 V(相对 Ag/Ag+ ) ,在液相中易被氧化。化学氧化法是在一定的反应介质中加入特定的氧化剂 ,使得单体在反应中直接生成聚合物并同时完成掺杂过程 ,与电化学的掺杂不同 ,因为其中加入了两种物质 ,并且这些物质进入了聚合物的主链 ,对聚合物的电化学性质产生了非常重要的影响。常用的氧化剂有 (NH4)2S2O8, FeCl3 , H
10、2O2 , K2Cr2O7 , KIO3等。介质常选用水、乙醚、乙腈、酸溶液等。研究表明表面活性剂的加入可提高聚吡咯的导电性 ,还可增加聚吡咯的产量。制备过程中 ,除表面活性剂的加入之外 ,单体的浓度、氧化剂的性质、氧化剂与单体浓度的比例、聚合温度、聚合气氛、掺杂剂的性质以及掺杂程度等因素都会影响导电聚合物的物理和化学性质。 聚吡咯的电化学合成通常采用传统三电极体系 ,电解质溶液是含吡咯单体和对阴离子的有机或水相溶液。采用恒电流、恒电位或循环伏安法进行电解 ,使单体在电极表面由电氧化 引发生成聚吡咯薄膜。电化学氧化法是通过控制电化学氧化聚合条件 (含吡咯单体的电解液、支持电解质和溶剂、聚合电位
11、 /电流和温度等 ) ,在电极上沉积为导电聚吡咯薄膜。电化学聚合的电极可以是各种惰性金属电极 (如铂、金、不锈钢、镍等 )及导电玻璃、石墨和玻炭电极等。电极体系不同 ,掺杂剂不同 ,聚合电流或电压也有差异。能够进行掺杂的对阴离子可以是无机阴离子、有机阴离子 ,也可以是聚电解质等大分子 ,如硝酸根、氯离子、硫酸根、四氟硼酸根、对甲苯磺酸盐、蒽醌磺酸、苯碘酸、聚苯乙烯磺酸盐、聚乙烯硫酸盐、聚乙烯醇等。因掺杂阴离子种类的不 同 ,聚吡咯的电导率往往可以相差若干个数量级。 1.3 聚吡咯功能化 1.3.1 聚吡咯功能性单体共聚 通过合成吡咯与功能性吡咯单体，并进行共聚合，是制备导电聚吡咯共聚物最常用的
12、方法一方面聚合物材料的导电性能不受吡咯单体存在的影响：另一方面聚合物材料因功能性吡咯单体的引入而富含各种功能基团，如羧基、羟基和氨基等，继而增加了蛋白质在材料基底表面固定的方式。张治红等采用氧化聚合法分别合成了吡略与功能性吡咯衍生物的导电共聚物poly(Py-co-PyHA)和 poly(Py-co PyCA)薄膜随着功能性吡咯 单体比例 f体积比 )的增加，功能性基团在两种共聚物中的含量也随着增大两种共聚物薄膜均具有一定的电化学活性，但与聚吡咯薄膜相比，其电化学活性有所降低，但通过其他检测手段发现通过改变反应单体的比例，可以3 调整共聚物的化学组成 制备出对蛋白质吸附程度不同的功能性导电聚吡
13、咯共聚物薄膜，进而有望开发出更加敏感可控的蛋白质芯片。 4 1.3.2 与其他聚合物的复合 这一类主要因为聚吡咯不溶不熔 ,并且一般方法制备的导电聚吡咯力学性能较差 ,这限制了它的应用。如能将它的导电性与尼龙等聚合物的高柔韧性和高力学性能相结合 ,将可 得到广泛应用。门吉英 ， 邓小燕 等人通过 乳液聚合法制备导电性聚吡咯 /聚乳酸 (PPy/PLA)复合膜。扫描电镜观察表明 ,复合膜中的聚吡咯粒子形成连续的小 或 分散在可生物降解的聚乳酸骨架中 ,红外光谱检测显示有 PPy 和 PLA 的典型吸收峰。复合膜电导率衰减缓慢 ,导电性稳定 ,在 560h 1146h 电流持续保持在 28A 35
14、A 之间。扫描电镜显示原代培养的成骨细胞能在导电性 PPy/PLA 复合膜上很好地粘附和铺展 ,说明复合膜具有良好的细胞相容性 5。宋诗稳 , 于浩等以碳纳米管修饰的复合陶瓷碳电极为基础电极 , 采用循环伏安法 制备了 PPy/HCF 复合膜研究了该修饰电极的电化学性质及对NO2- 的电催化活性。结果表明 , 该复合膜与碳纳米管的协同催化使修饰电极对亚硝酸根的还原表现出了良好的电催化活性 , 据此建了测定 NO2- 的新方法 ,并用于模拟水样中 NO2含量的测定。 6中科院化学有机固体实验室研究了导电聚吡咯 /尼龙复合膜的制备，研究表明复合 PPy 后使得尼龙的结晶度和结晶完整性显著增加，复合
15、膜表面的 PPy 具有网状结构。另外研究成员还研究了 PPy与一些其他基质聚合物 (弹性体、结晶性聚合物及液晶性聚合物 )的复合材料 7，当其与聚 氨酯弹性体进行复合时，吡咯与掺杂剂需要通过溶涨的聚氨酯到达电极表面进行一层层叠加的氧化聚合，此时扩散作用是决定反应进程的基础， PPy 在基质中呈网状排列。日本的宫田等人制备的聚乙烯醇 /聚吡咯复合膜，导电率达到 10 s/cm ，可见光透过率在 550 nm 处可达 80% 95%。 8 1.3.3 PPy/无机粒子 复合材料不但具有 PPy 的电学、磁学以及光学性能 ,而且还具有良好的成膜及加工性能 ,表现出了传统的导体、半导体、铁磁体等的功能
16、 ,而且具有传统材料所不具备的某些特性。 导电聚合物与无机磁性粒子的复合 ,会 兼有导电聚合物和无机磁性粒子各自的优点 ,在电学、光学、力学和磁学等方面赋予复合材料新的特点 ,如密度小和良好的加工性能等 ,且其在电池、电化学显示装置、电磁屏蔽和微波吸收材料等方面具有潜在的应用价值 ,从而引起广泛关注。目前 ,有多种方法制备 PPy/无机磁性粒子纳米复合材料 ,复合的磁性无机粒子主要包括 Fe3O4 、 Fe2O3 、 M 型钡铁氧体和铁酸盐等。 9 金属氧化物具有良好的半导体性质 , 如 MoO3 、 SnO2 、 Y2 O3 、 Sb2 O6 、 PbO2 、 TiO2 、 MnO2 、Zr
17、O2 和纳米 A12O3 等 。将其与纳米 PPy 复合可以制备出具有良好光电性质的新型复合材料。用炭4 黑吸附化学氧化聚合法制备了 PPy/导电炭黑复合材料。导电炭黑的加入不仅提高了材料的电导率( 由原来的 6.52 S/cm 增加至 13.42 S/cm ,而且提高了材料的堆积密度 , 改善了 PPy的颗粒形态和制膜加工性能 10。 1.4 蛋白质直接电化学研究 蛋白质直接电化学为揭示蛋白质 (酶 )的结构 -功能关系提供了一条有效途径 ,也为进行蛋白质电子传递过程的热力学和动力学研究提供了强有力的方法 ,已经成为制备新一代电化学生物传感器领域的重要手段 。蛋白质在材料表面吸附的研究是发展
18、先进生物芯片、生物传感器、生物反应器 , 以及一些新型诊断技术的基础 11，目前 , 蛋白质的直接电化学在金属、金属氧化物、金属纳米粒子、单分子层膜、以及高聚物上的吸附被广泛研究。 12 1.4.1 生物膜和生物模拟膜电极构筑及蛋白质 /酶直接电化学 在生命体内，类脂双分子层构成生物膜的基本结构单元。类脂具有典型的双亲结构。即疏水的碳氢长链和亲水的极性基团蛋白质就吸附在生物膜表面或嵌入其内部。我们知道，生物体内很多电子传递蛋白都是膜蛋白，表明生物膜环境有利于蛋白质的电子传 递。蛋白质在模拟生物膜微环境中的电化学行为，很可能更接近于其在生命体内的电子转移过程。 1.4.2 基于纳米粒子组装体系的
19、蛋白质 /酶直接电化学 随着纳米材料的诞生和纳米科技的发展纳米材料所具有的独特物理化学性质为生物电化学的研究提供了一条崭新的途径。由于氧化还原蛋白质 /酶很难实现在裸露固体电极上的直接电子传递，很大程度上限制了新型无媒介体生物传感器和生物燃料电池的研制。而纳米粒子由于其小尺寸、大的比表面积而具有独特的电子、光学和异相催化等特性及其纳米粒子本身的生物相容性为该研究注入了新活力。 13 1.4.3 基于碳纳米管组装体的蛋白质酶直接电化学 自从上世纪 90 年代初 Iijima 发现碳纳米管以来由于其具有尺寸小，比表面积大，吸附性能强电导率高，机械强度高等优异的物理化学性能因此在工程材料、催化、吸附
20、一分离、储能器件、燃料电池等方面有着广阔的应用前景。近年来，碳纳米管在生物电化学领域的研究受到广泛关注。碳纳米管依据其原子结构不同，将表现为金属或半导体，这种独特的电子特性使得它制成电极时能促进电子的传递并且碳纳米管具有导电性和完整的表面结构。因而它将是一种良好的电极材料。另外，利用碳纳米管对电 极表面进行修饰时，将其材料本身的物化特性 (如大比表面积，表面易修饰功能化等 )引入电极界面，从而对某些特定物质产生特有的电催化效应。基于碳纳米管这些独特的电子和结构性质也决定了其在蛋白质直接电子转移的研究中具有潜在的应用价5 值。 1.5 辣根过氧化物酶 (HRP) 辣根过氧化物酶 (HRP)是一种
21、蛋白质，其比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。 HRP 广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量 18 %。 HRP 由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等电点为 PH 3 9,酶催化的最适 PH因供氢体不同而稍有差异，但多在 pH5左右。酶溶于水和 58以下饱和度硫酸铵溶液。 HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为 403 nm 和 275 nm，一般以 OD 403 nm/OD 275 nm 的比值 RZ表示酶的纯度。高纯度的酶 RZ值应在 3.0左右 (最高可达 3.4)。 RZ 值越小，非酶蛋白就越多。 电流型过氧化
22、氢生物传感器通过辣根过氧化物酶 (HRP)来催化底物在电极上反应产生电流响应来检测 H2O2。葡萄糖、酒精、谷氨酸、胆固醇等通过酶促反应产生的过氧化氢也可以用过氧化氢生物传感器进行 检测，因此，过氧化氢生物传感器在化学分析、生物分析、医药、临床、环境等领域中具有重要的研究意义 14。一般来说， HRP 作为生物传感器的识别分子很难在电极上直接得失电子，通常需要在 HRP 和电极之间使用电子媒介体来转移电子，因此， HRP 在较低的电位下即能比较容易地催发 H2O2在电极上反应，降低了溶液中其它电活性物质如抗坏血酸、尿酸等的干扰。目前，采用不同的电子媒介体的电流型生物传感器用于检测 H2O2的文
23、献已有报道，如张国荣等将水溶性的中性红 (NR)经电聚合修饰在浸腊石墨电极表面制成的辣根过氧化物酶生物传感器15，孙康等以 Nafion 膜固定的新亚甲基蓝为辣根过氧化物酶和玻碳电极间的电子传递介体，制成电流型单酶过氧化氢生物传感器 16，韩树波等利用体环糊精聚合物及 -CDP 与亚甲基蓝问的超分子作用及 -CDP 与戊二醛间的缩聚作用，将介体和酶共同固定在电极上 17。这类生物传感器具有检测灵敏度高、检测范围宽，响应速度快等优点，但是传感器的制备工艺相对来说较为复杂，不容易实现大批量制作，而且传感器之间的一致性难以保证。 18 1.6 本课题的意义 研究氧化还原蛋白质的直接电化学可以提供能量
24、转换和代谢过程的生命 信息，对阐述生物能量传递具有重要的意义，同时为揭示蛋白质 (酶 )的结构 -功能关系提供了一条有效途径，也为进行蛋白质电子传递过程的热力学和动力学研究提供了强有力的方法。 蛋白质在生物体内广泛存在于荷电界面上，如生物膜就是一种荷电界面。电极作为一种研究荷电界面的模型系统，有助于我们深入了解蛋白质在生物膜中发生电子传递的分子机制。其研究，首先，可以方便地获得蛋白质的热力学和动力学性质，有助于深入了解蛋白质电子传递过程；其次，由于蛋白质直接电化学涉及界面专一性、界面相容性和蛋白质的变性问题等，因此在研究过程中可以得到很 多关于生物大分6 子界面问题的启示，进而模拟生物体内的电
25、子传递过程；再次，从应用角度，这项研究把电极与生物大分子联系起来，可以获得一种专一的电催化模式，以实现高灵敏度和高选择性的分子传感 。 本课题以固定在玻碳电极（ GCE） 上的多壁碳纳米管（ MWCNTs）为基底 ,利用循环伏安法对含有十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB） 和吡咯单体的盐酸溶液进行电化学聚合，形成掺杂 CTAB的聚吡咯 (PPy)/MWCNTs修饰的玻碳电极（ CTAB-PPy/MWCNTs/GCE）。再将辣根过氧化物酶（ HRP）固定于修饰电极上，研究蛋白质的直 接电化学。 2 实验部分 2.1 仪器和试剂 2.1.1 仪器 用 KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）进行超声；用 Anke TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）进行离心洗涤；用 DZX 1型（ 6050B)真空干燥箱（上海福玛实验设备有限公
