1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 抗癫痫药物与血清白蛋白相互作用的光谱学研究 所在学院 专业班级 环境工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 蛋白质是生命有机体的重要组成部分，它几乎参与了所有的生命过程。 本次实验采用荧光光谱法和 紫外光谱法研究抗癫痫药物与牛血清白蛋白在缓冲溶液中的相互作用。结果处理运用荧光猝灭双倒数图计算在不同条件下二者的结合常数 K；根据福斯特非辐射能量转移理论，求出不同温度时二者之间能量转移的效率和结合距离；根据热力学参数确定抗癫痫药物和牛血清白蛋白之间的作用类型。实验结果表明抗癫痫药物和牛血清白蛋白形成了复合物，且有较强的相互
2、作用，以氢键和范德华力为主。荧光技术表明抗癫痫药物对牛血清白蛋白的构象有影响。 关键词 :卡马西平；血清白蛋白；相互作用；荧光光谱 II Abstract: Proteins are very important in living organisms and take part in almost all life processes. This experiment using fluorescence spectrometry and ultraviolet spectrometry research antiepileptic drugs and bovine serum albumi
3、n in buffer solution interaction. Results treatment using fluorescence cu destroy double bottom graph calculation in different conditions the combination of two constants K; According to foster the radiation energy transfer theory, to work out the different temperature between energy transfer when t
4、he efficiency and combined with distance; according to the thermodynamics parameters antiepileptic drugs and bovine serum albumin of action between type. Experimental results show that antiepileptic drugs and bovine serum albumin formed complex, and a stronger interaction to hydrogen bond and Van de
5、r Waals force primarily. Fluorescence shows an antiepileptic drug of bovine serum albumin conformation of have influence. Keywords: Carbamazepine； Serum albumin ； interaction ； fluorescence spectrum目 录 摘要 .I Abstract . II 1 绪论 . 1 1.1 引言 . 1 1.2 药物小分子与蛋白质相互作用的相关研究 . 2 1.2.1 荧光光谱法 . 2 1.2.2 红外光谱法 . 3
6、 1.2.3 紫外光谱法 . 3 2 实验部分 . 4 2.1 仪器与材料 . 4 2.2 实验流程 . 4 2.3 分析方法 . 4 2.4 实验内容 . 4 3 结果与分析 . 6 3.1 荧光分析 . 6 3.1.1 结合常数 Kq 确定 . 6 3.1.2 Forster 偶极 -偶极无辐射能量转移估测药物分子 . 11 3.1.3 荧光猝灭过程中热力学函数的变化与作用力判断 . 12 3.2 紫外分析 . 13 4 结论 . 14 致 谢 . 15 参考文献 . 16 1 1 绪论 1.1 引言 癫痫是困扰人类的顽疾，我国的患者总人数在 900 万左右，患病率为 7 。癫痫的临床表现
7、复杂，多种多样，在我国，很多患者尚未得到正规的诊断和治疗。长期反复出现的癫痫发作给患者带来了 严重的躯体伤害，防碍到患者生活、学习和就业，造成严重而深远的社会心理影响。 癫痫是常见的慢性惊厥性疾病，发作时脑部病灶发生一种异常的高频放电，并向病灶周围正常脑组织扩散，引起脑细胞广泛的兴奋，从而出现特有的惊厥症状，并伴有运动、感觉、意识、行为、植物神经等功能障碍。 在癫痫发作的治疗中， 抗癫痫药 物有特殊重要的意义 ， 可通过两种方式来消除或减轻癫痫发作，一是影响中枢神经元，以防止或减少他们的病理性过度放电；其二是提高正常脑组织的兴奋 阙 ，减弱病灶兴奋的扩散，防止癫痫复发。 抗癫痫的药物有很多种如
8、 卡马西平、丙戊酸钠 、 苯巴 比妥、苯妥英钠 等。 蛋白质是生命活动的基础物质，也是构成人体新生组织，维持人体健康的重要组成成分。血清白蛋白作为一种储存和运输蛋白，是血浆中含量最丰富的蛋白，它能和许多内源性或外源性物质结合。 药物分子进人血液后随着血液循环分布于全身，必然不同程度地与血浆蛋白 (主要是血清白蛋白 )结合。所以，药物一血清白蛋白的结合直接影响药物在生物体内的分布、贮存、转运、药效、药物代谢以及毒副作用等方面的性质。 研究其与药物分子的相互作用，不仅对于阐明药物的运输与代谢过程非常有意义，而且对于阐明药物机理，药物动力学和 进行药物分子 设计、开发新药等也具有重要的指导意义 1。
9、 卡马西平（ C15H12N2O2， 图 1.1） ， 是一种常用的抗惊厥和抗癫痫的药物， 用于治疗癫痫大发作、精神运动性癫痫和局限性癫痫等效果较好 ， 亦可用于三叉神经痛。对某些精神疾病包括精神分裂症性情感性疾病，顽固性精神分裂症及与边缘系统功能障碍有关的失控综合征。预防或治疗躁狂 -抑郁症。中枢性部分性尿崩症 它能通过与蛋白质中谷氨酸的作用稳定过度兴奋的神经细胞膜，抑制反复的神经放电，封闭电压依耐性纳离子通道，减少突然摸触对兴奋冲动的传递，起到抗惊厥和抗癫痫的作用心。 图 1.1 卡马西平结构式 2 抗癫痫药物 对多种 条件 引起的惊厥，均有不同程度的对抗作用。对人的各型癫痫如对各型小发作
10、、 肌阵挛 性癫痫、局限性发作、大发作和混合型癫痫均有效 ， 主要分布在 细胞外液 ，在血中大部分与 血浆蛋白 结合 。 因此，研究卡马西平与牛血清白蛋白 (BSA)相互作用对于了解卡马西平在人体内与蛋白质的结合方式、传输机理及药理作用具有理论指 导和现实意义。 1.2 药物小分子与蛋白质相互作用的 相关研究 近年来，人们采用多种现代实验手段从不同角度对药物与血清白蛋白之间的作用进行了广泛研究。目前常用的方法有：荧光光谱、傅里叶转换红外光谱、 紫外光谱法、 核磁共振、圆二色光谱、质谱、电化学、电泳等方法。 1.2.1 荧光光谱法 荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段 2,
11、3 ，它能提供包括激发光谱、发射光谱、斯托克斯位移、荧光强度、量子产率、荧光偏振和荧光寿命等参数。通过对这些参数的测定，可以推断蛋白质分子在各种环境中的构象变化 、色氨酸或酪氨酸残基的微环境变化、蛋白质的变性等，从而进一步阐明蛋白质结构与功能的关系。同时，荧光光谱法还具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点，因此在研究药物小分子与蛋白质相互作用中荧光光谱占有重要地位 4,5 。 荧光光谱法是研究小分子与血清白蛋白相互作用的主要手段，也是目前研究较为活跃的方法。蛋白质中色氨酸、酪氨酸的存在使其具有内源荧光，在 345nm处有最大荧光峰。随着药物的加入，人血清白蛋白 (HSA)或牛血清白蛋
12、白 (BSA)的荧光强度有规律的降低，说明药物对 HSA或 BSA有荧光猝灭作用。 根据猝灭曲线可以求得药物与 HSA(或 BSA)的结合常数，确定猝灭类型。根据荧光光谱和吸收光谱可获得药物与 HSA(或 BSA)的结合位点数，及药物与 HSA、 BSA上色氨酸残基的距离，根据反应焓变、熵变确定它们之间的相互作用力 。另外根据发射波长的移动可以判断蛋白质构象的变化。张勇等 6利用荧光猝灭法研究了丝裂霉素与血清白蛋白以及金属离子间的相互作用，结果表明血清白蛋白与丝裂霉素的结合常数 KHsA=1.64104mol L、 KBSA=1.89l04mol L， Fe3+、 Zn2+、Mg2+存在使结合
13、常数降低， Cu2+使结合常数增大。丝裂霉素与牛血清白蛋白的结合位点数为 l，丝裂霉素距色氨酸残基距离 rHSA=4.24nm,rBSA =3.76nm。它们之间的相互作用力为疏水作用力。黄波等 7研究了阿霉素与牛血清白蛋白结合作用，结果表明阿霉素的加入使 BSA的构象发生了变化。卢继新等 8,9研究了在金属离子存在下甲氨喋呤、巯嘌呤与血清白蛋白间的相互作用，研究表明金属离子存在使药物与血清白蛋白之间的结合增强、结合位点数发生改变。文献 10副研究了氯丙嗪和氯高铁红素与牛血清白蛋白的相互作用，结果表明氯高铁红素可以增强 氯丙嗪对的 BSA猝灭作3 用，使 BSA的构象发生变化。文献 11,12
14、则报道了抗生素类药物与血清白蛋白结合的作用模式。近年来该法也用于中草药中有效成分与蛋白质相互作用的研究 13-16，得出一些有益的结论。 1.2.2 红外光谱法 红外光谱是研究小分子药物与血清白蛋白相互作用的新方法，它可以从蛋白质二级结构变化的层次来探讨其结构与功能的关系。谢孟峡等 17运用蛋白质红外光谱酰氨 带和酰氨 带结合的方法对人血清白蛋白与 -1， 2， 3， 4， 6-五 -0-倍酰 -D-葡萄糖 (PGG)作用后二级结构的变化进行了定量分 析，结果表明随着药物浓度增加， PGG和 HSA之间的相互作用主要使 HSA的二级结构发生了 a螺旋向 -转角和无规结构的转化。刘媛等 18应用
15、衰减全反射傅里叶变换红外光谱研究了中草药三七总皂甙对牛血清白蛋白溶液构象的影响，实验表明随着三七总皂甙浓度增加，蛋白质分子结构逐渐发生了由螺旋向折叠的转化。谢孟峡等 19研究了 4、 5、 7-三羟基二氢黄酮与人血清白蛋白相互作用方式。 1.2.3 紫外光谱法 DNA分子中的碱基具有光学活性，在 260nm波长附近有最大吸收。热和碱的作用可破坏 DNA双链螺旋结构使双链变单链， 260nm波长处吸光度增大。小分子与 DNA结合后会给这种变性带来影响，可通过观察药物小分子与 DNA作用前后， 260nm处吸光度随温度或 pH变化来判断药物与DNA作用方式。当药物小分子与 DNA发生嵌插结合时，由
16、于插到 DNA双螺旋碱基中的小分子对DNA结构起到稳定作用，可使 DNA变性温度 Tm值显著上升 20,21， DNA 碱变性 pH值会相应增大，增色效应相应减小 20。文献 22用碱变性曲线研究了有机锗配合物 (Ge l32)与 DNA 的作用方式，初步判断 Ge l32以嵌插方式与 DNA发生作用。药物小分子与 DNA发生嵌插结合时也会引起吸收带的红移 (蓝移 )现象或增色减色效应。吸光度减小，吸收带红移及等吸收点的形成是小分子与 DNA发生嵌插作用的光谱标志 23。曹瑛等 24用紫外光谱研究了吩噻嗪类药物与 DNA的作用，结果表明具有平面吩噻嗪环的三种药物盐酸氯丙嗪 (CPZ)、盐酸三氟
17、拉嗪 (TFD)、盐酸异丙嗪 (PMZ)与 DNA作用的电子光谱不同。 CPZ在 306nm处有最大吸收，在约 330nm处形成等吸收点，说明 CPZ与 DNA发生了嵌插作用，而 TFD和 PMZ却没此现象出现，说明它们与 DNA作用方式不同于 CPZ。 4 2 实验部分 2.1 仪器与材料 相关仪器 型号 厂家 分子荧光分光光度计 Gary Eclipse Varian 电子天平 AL204 METTLER TOlEDO 紫外分光光度计 UV-2550 SHIMADZU CORP 药品 分子式 厂家 卡马西平 C15H12N2O2 江苏恩华药业股份有限公司 三羟甲基氨基甲烷（ Tris） (
18、HOCH2)3CNH2 北京鼎国生物技术有限公司 牛血清白蛋白 V（ BSA） 北京鼎国生物技术有限责任公 司 盐酸 HCl 衢州巨化试剂有限公司 NaCl NaCl 宁波市化学试剂有限公司 2.2 实验流程 配制 PH=7.4 的 Tris-HCl 缓冲溶液用于体系的稀释剂，配 卡马西平 溶液和 BSA 溶液准备液，不同 卡马西平 溶液浓度与 BSA 相互作用的影响，通过分子荧光光谱分析和紫外分析予以讨论。 2.3 分析方法 荧光分析法，紫外 分析法 2.4 实验内容 2.4.1 配制 0.1mol/L 1L PH=7.4 Tris-HCl 缓冲液（ Tris-HCl 0.1mol/L ;
19、HCl 0.1mol/L; NaCl 0.1mol/L） 2.4.2 配制 2.510-5 mol/L BSA 溶液（以 Tris-HCl 缓冲液为稀释剂） 配制 1.510-4mol/L 卡马西平 溶液（以 Tris-HCl 缓冲液为稀释剂） 2.4.3 准备 5 支 10ml 容量瓶标为 0、 1、 2、 3、 4、 5.，各加入 BSA 溶液 5mL，再分别对应加 入 0、 1、 2、 3、 4、 5（ ml） 卡马西平 溶液，用 PH=7.4Tris-HCl 溶液定 容 至刻度。摇匀，放置 一段时间 。 2.4.4 对 5 个样品在 25C、 30C 、 37C 下进行荧光分析。 5
20、2.4.5 对 5 个样品进行紫外分析 。 6 3 结果与分析 3.1 荧光分析 对 BSA 预扫描，记录 BSA 最大激发波长 228nm,最大发射波长 339nm。因此，以 228nm 为激发波长，记录 BSA 的荧光光谱及 卡马西平对 BSA 的荧光猝灭，以 228nm 为激发波长，记录 BSA和含不同浓度 卡马西平 时 BSA 的发射 光谱。 图 3.1 卡马西平对 BSA 荧光猝灭光谱 3.1.1 结合常数 Kq 确定 分子间的作用不同可以导致不同的猝灭方式，典型的猝灭方式有动态猝灭和静态猝灭。二者的区别在于猝灭常数受温度变化影响的不同。动态猝灭是荧光体与猝灭体由于热运动等发生碰撞而引起的，它依赖于扩散，升高温度导致扩散加快，故猝灭常数将随着温度的升高而增大；静态猝灭是荧光体与猝灭体形成络合物，从而使荧光体的荧光猝灭由于升高温度将使化合物的稳定性降低，因此，静态猝灭常数的值将随温度的升高而降低，且静态猝灭曲线对浓度的变化表现出较好的线性 关系。 为了确定此猝灭过程的机制，先按动态猝灭过程处理，那么服从 Stern-Volmer 方程： )(1)(1 00 QckQckFF dq (1)
