1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 四种重金属对淡水发光菌的联合毒性研究 所在学院 专业班级 环境工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 ： 事实上 ， 当待测生物暴露在混合污染物中时 ，其所受的影响不是单一污染物的作用的简单加和，而是各 混合物中各 组分相互影响 ， 产生 的 联合毒性作用，表现为加和作用、协同作用和拮抗作用。为了深入了解重金属混合物的联合毒性对发光细菌的作用，利用淡水发光细菌 青海弧菌 Q67(Vibrio qinghaiensis sp.nov-Q67)发光值的测定方法 。本实验以 硫酸镍，硝酸铜，硝酸钡，六水合硝酸钴为研究对象，在测得
2、其单一 EC50的基础上，对上述物质进行二二自由组合，测得其联合毒性，实验结果表明， 硫酸镍 /硝酸铜，硫酸镍 /六水合硝酸钴，硝酸钡 /硝酸铜的联合作用为拮抗作用，硝酸钡 /六水合硝酸钴为相加作用，硝酸铜 /六水合硝酸钴协同 作用。 关键词 ： 联合毒性 ； 发光细菌 ； 二元混合物 ； 重金属 。II Abstract: In fact ,When the test biological exposure to mixed pollutants,the influence is not a single simple addition but a mixture of mutual inf
3、luence of each component. The joint effects of substance in a mixture can be categorized as antagonism, synergism and only additive. Joint toxicity effects of heavy metals on luminescent bacteria Vibrio qinghaiensis sp.nov-Q67 was investigated in this paper. The experimental material is nickeloussul
4、fate ， Nitric acid copper ， Nitric acid barium and Six hydrated nitric acid cobalt. The materials is Free combined by measured on the basis of the single toxicity . The results show that, Combined effects of the metals were found to be antagonistic for nickeloussulfate/ Nitric acid copper, nickelous
5、sulfate/Six hydrated nitric acid cobalt, Nitric acid barium/ Nitric acid copper, addition for Nitric acid barium/ Six hydrated nitric acid cobalt, synergism for Nitric acid copper/ Six hydrated nitric acid cobalt. Keywords: joint toxicity; luminescent bacteria; binary mixtures; heavy metals.目 录 1 绪论
6、 . 1 1.1 选题的背景、意义 . 1 1.2 相加指数法相关概念 . 1 1.2.1 相加指数法 . 2 1.2.3 EC50 的概念 . 2 1.2.4 建议的毒性评价方法 . 3 1.3 相关研究概况 . 3 1.3.1 我国发光菌的研究概况 . 3 1.3.2 发光菌检测法的应用 . 3 1.3.3 污染物联合毒性研究 . 5 2 理论与实验方法 . 7 2.1 理论测试方法和计算方法 . 7 2.1.1 单一毒性的测试方法 . 7 2.1.2 联合毒性的测试方法 . 7 2.1.3 理论计算方法 . 7 2.2 实验方法 . 8 2.2.1 实验原理 . 8 2.2.2 试剂与仪
7、器 . 8 2.2.3 发光细菌冻干菌剂的复苏 . 9 2.2.4 培养液的配置 . 9 2.2.5 培养基的配置 . 9 2.2.6 发光菌的培养 . 9 2.2.7 毒性测试 . 9 2.2.8 数据处理 . 10 3 结果与讨论 . 11 3.1 结果 . 11 3.1.1 单一毒性实验数据记录 . 11 3.1.2 二元混合物相对发光率 . 11 3.1.3 二元混合物的 EC50min . 12 3.2 小结 12 4 结论 . 14 参考 文献 . 15 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 选题的背景、意义 随着工业农业的迅速发展，大量污染物进入环境。其中重金属
8、对环境的影响是巨大的 ，会对生态系统和人类健康产生潜在的长远的危害 1，当然对重金属进行毒性的测定也是刻不容缓的事。并且，有环境危险因素对生态系统和人类健康的有害效应并不是单一污染物作用的结果，而是各种 污染物混合作用的结果。 待测生物暴露在混合污染物中时，由于混合物中各组分相互影响，会产生联合毒性 2作用，表现为加和作用、协同作用和拮抗作用 3-4。 （一）首先，要保护环境，其中第一步就是正确监测环境污染的情况。目前主要是用物理仪器和化学分析相结合的方法。这类方法的优点是能准确定性和定量，但是其仪器设备往往价格昂贵，技术要求和使用成本很高，只能在实验室里使用，即使不考虑这些仪器的昂贵价格及其
9、他不便因素，仍然有一个重要问题：这样的毒物泄露到底对人类的健康有多大危害？尤其是中，远期危害，上述检验是无法直接回 答这个问题的。要回答对人群健康的影响，即对生物毒性大小的判断，必须用生物医学的方法对污染的生物毒性进行分析。目前较常用的是检测污染物毒性的方法是从医学物理学的方法引用过来的小鼠，鱼，或藻类毒性实验，但其有不可克服的缺点，如时间长，要有专门的人员操作，成本大，个体存在差异等。而应用发光细菌来检测污染物毒性则能克服这些缺点，具有 方便、灵敏、高效 进行等优点而被广泛应用 5-6 ， 化合物对发光菌的毒性与对其它生物的毒性数据有一定的相关性 7在有毒物质的筛选和环境污染物的生态风险评价
10、等方面具有重要意义 8。 作 为微生物的学术研究，发光菌是微生物中很独特的微生物。虽然有关于微生物的发光能力是如何让形成和展开的，在学术界上依旧没有一致的答案，但是这并不影响它在实际研究中的广泛应用，显示出其巨大的应用价值。在实际环境毒性检测中常用到的是海洋发光菌和淡水发光菌。其中海洋发光菌由于适应高浓度的海水盐度，所以检测时，必须在相当于海水盐度的溶液中才能进行。对于一般的淡水样品，需要的 NaCl 的浓度为 3才能进行测验。随着发光菌应用于环境污染的毒性检测日益增多，许多研究者发现，对于有些品种的样品，其测验结果往往与其他生物测试的结果 不大吻合，尤其是那些含有重金属的样品。究起原因，多数
11、认为是由于添加了高浓度的NaCl 所致，于是，有学者拟用葡萄糖代替氯化钠调节渗透压，使之与其海洋环境成等渗溶液，但效果并不理想结果重复性较差。因为使海洋菌持续稳定的发光，必须要有在高浓度的 Na 离子的存在。这就一直成为海洋型发光菌的在环境毒性检测应用的限制。 淡水发光菌 -青海弧菌 9， 1985 年我们从我国青海省的青海湖所产的青海裸鲤体表分离到 70余株发光菌。经鉴定，为弧菌属的一个新种，被定义为青海弧菌。其具有较海洋发光菌更优异的生理特征。对 NaCl 的耐受 实验表明， NaCl 浓度在 1时生长良好，在 5时仍生长和发光良好，8时为其生长的上限。表明起具有较强的耐盐及耐高渗透压的能
12、力。在 PH6 至 11 范围内均能生长并发光。 PH=9 是其生长和发光的最佳 PH。明显与其它发光菌的最适 PH 不同。并且，青海弧菌为非致病菌，因此很有利于应用，现在在环境毒性检测方面的应用相当方便。 由于青海弧菌特殊的性质，在应用于环境毒性检测时 其不要 Na存在有能生长发光良好，排除2 了额外加入 NaCl可能造成的影响。 并且，新鲜培养的青海弧菌能在蒸馏水里能良好发光，且稳定发光课持续 30min以上， 因此，在淡水样品的检测中可以用蒸馏水做空白对照。而淡水样品也不需要做任何额外添加物，直接将青海弧菌加进去就行了。此外，由于该细菌对 PH有较宽的适应力，在 PH为 5 5 9 0之
13、间均可以。也就是说， PH对青海弧菌的发光影响可以忽略不计，因而一般不需要对样品做 PH的调整即可用于检验。 （二） 其次，对于 4种重金属 10对发光菌的急性毒性和联合毒性研究在方法的选取上，使用相加指数法 ，判别方法简单，是最早研究联合毒性的方法，方法较为成熟。在判别相加作用时具有较好的可靠性，曾得到较为广泛的应用。 Tu法还可判断有机混合 物联合毒性的强弱。重金属的联合毒性作用主要有叠加，协同或拮抗作用。所谓叠加是指两种离子产生的共同作用所产成的抑制发光的程度，比他们各自单独作用时的啊，但小于单纯的相加值，所谓协同，是指两种离子共同作用时的发光率，大于他们单独作用时的简单加和，而所谓拮抗
14、作用则是指两种离子共同作用的发光率反而小于他们单独作用的抑光率，或至少小于其中一种离子的单独作用的抑光率。 1.2 相加指数法相关概念 1.2.1 相加指数法 相加指数法是在毒性单位概念的基础上发展起来的。毒性单位是指当试验溶液的毒物浓度等于该毒物对某种 水生生物的半数效应浓度 (EC50)时 ， 则试验溶液对水生生物的毒性强度就为一个毒性单位。根据这个原理，混合物中第 i 组分的毒性单位可表示为 x(TUi)=ci/(EC50， i) (1) 其中： ci为混合物中第 i 组分的浓度， (EC50， i)为第 i 种化合物单独作用时的半数效应浓度。相加指数法最早是由 Marking 提出来的
15、。若令 M=x(TUi)，即各组分的毒性单位之和，则相加指数的计算公式可表示为： AI=M-1 (M=1 时 ) AI=1/M-1 (M1 时 ) 相加指数法的评价标准 ： 当相加指数等于 0 时 ， 为简单的相加作用 ； 当相加指数小于 0 时 ，为拮抗作用 ； 当相加指数大于 0 时，为协同作用。相加指数等于 0 是一种理想的相加作用 ， 在实际实验中，由于存在误差，即使是相加作用 ， 也很难恰好得到相加指数等于 0 的结果，因此 Marking提出若相加指数的置信区间包含 0，就认为是相加作用随着合成化合物种类的增加。 1.2.3 EC50的概念 EC50即发光菌发光强度降低 50%时毒
16、物的浓度。实验结果显示，毒 物浓度与菌体发光强度呈3 线性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。 目前，毒性实验中采用的指示生物主要是水生生物，常见的有线虫、发光菌(Photobacterium phosphoreum)、大型蚤、藻类、鱼类、蝌蚪、幼虾和夏吸虫等，也包括土壤动物如蚯蚓。 1.2.4 建议毒性的评价标准 样品建议的毒性评价标准 相对发光强度（ %） 样品的毒性评价 相 应 的 苯 酚 浓 度（ mg/L） 大于 90 无毒性 80至 90 轻微毒性 25至 50 50至 79 中等毒性 50至 180 10至 49 较大毒性
17、 180至 350 小于 10 强毒性 大于 350 1.3 相关研究概况 1.3.1 我国发光菌的研究概况 120 世纪 50 时年代，在我国首次有人做了相关研究。山东大学的薛庭耀教授对我国的发光菌做了报道，之后其又陆续对发光菌的生理做了相关研究，因此薛庭耀教授可能是我国最先对我国的发光菌做出研究的人。之后 20 世纪 70 年代华东师范大学的生物系的杨颐康教授和叶履平副教授开展了对我国发光菌的研究，从海洋生物中分离了 10 个发光菌细菌菌株。在 20 世纪 80 年代，华东师范大学发光菌研究组从我国 海域上分离得到上千发光细菌，经分别鉴定有六个种。值得一提的是，在青海省发现了发光细菌，经五
18、年详细的鉴定之后，发现了一个新的菌种，而且不需要NaCl 就能生长和发光，是一种罕见的淡水型发光细菌，就是青海弧菌，还有相关很多学者对此进行研究，对发光菌的研究取得了很大的进展。 纵观近 10 年来关于发光菌的研究，国内大部分已转向应用方面，尤其是在环境毒物的检测上，这方面的论文每年都发表很多，数量很多，最近也有将发光菌应用于食品安全方面。 1.3.2 发光菌检测法的应用 由于 L . B .T 技术具有应用范围广，灵 敏度高、相关性好，反应速度快等优点，因而被广泛应用在环境监测中。 （ 1） 海水污染毒性检测应： 厦门大学郑天凌 11等人对厦门市厦门大学附近海滨的海水利用发4 光菌检测法进行
19、了取样研究，不仅对取样的海域海水的水质做出了科学的评价，而且还对发光菌检测方法做了有意义的探索，发现盐度对发光菌的发光强度有明显影响，过高过低都会抑制其发光强度。 （ 2） 重金属污染的毒性检测应用：重金属对发光菌的单一毒性及联合毒性的研究， 索常温(25 )下水中汞，镉，铜和锌对青海弧菌 Q67的急性毒性效应 12，选取 OD600值 1 75最佳发 光状态菌液以 RS990l生物发光光度计为测试设备，按照第一部分研究建立的测试体系，测定水中汞，镉，铜和锌对发光菌半数发光抑制效应浓度 (Ec50)，索常温 (25 )下水中汞，镉，铜和锌对青海弧菌 Q67的急性毒性效应，获得 4种毒物的 EC
20、50，按毒性由小到大顺序为与对金鱼进行研究的结果相一致。 （ 3） 在检测河流，湖泊沉积物或底泥的毒性 13应用：刘爱菊，孔繁翔 2006 年报道，为了评估疏浚太湖五里湖的沉积物的生物毒性的影响，他们利用发光菌检测法对五湖里的沉积物进行急性毒性测验，比较了疏浚前后，沉积物的毒性，并用淡 水沉积物重金属质量基准的结果做参比。他们得到，尽管疏浚可以有效削减沉积物中的重金属污染物的总量，大不能显著的消减其毒性 （ 4） 发光菌在检测大气污染应用：可以利用发光菌检测大气污染物很在就被认识，吴自荣，章平等人报道了几种人所共知的有害气体对发光菌发光有抑制作用。但是其存在许多障碍，其中最主要的是怎样精确定量
21、气体，并保证用于检测的气体有充分的机会接触到发光菌而产生作用，影响到发光细菌。即便如此，在方法上存在着明显的不能精确定量的特点，但仍然可以说，。应用发光菌来快速评价大气或工业废气的生物毒性是可行的 （ 5） 检测工业固体废弃物的毒性应用：工矿企业在生产过程中产生的固体废物，随着生产的时序进行而不断增多，危害环境的恶果出现，因此对工矿企业废弃物的处置日益受到关注，对其所造成的污染如何控制也是不容忽视的其中对生物毒性的检测评估更是必须先行的工作，利用发光菌的机型毒性检测方法对工业固体废弃物进行毒性检测是很有效很方便的。 1990 年朱文杰和汪杰曾对此做过实验，得出采用固体废弃物浸出液来反映其毒性是
22、可行的，发光菌急性毒性检测方法具有足够的灵敏度。谢思琴，顾宗濂报道了对几种工业固体废弃物用明亮发光杆菌冻干粉进行急性毒性检验 。表明用发光菌检测工业固体废弃物的急性毒性事很可靠的，是可行的。此外，他们还对工业固体废弃物经处理后的毒性变化用发光菌进行检验，结果表明，处理后毒性明显降低，有的废渣毒性已消除，有机物含量下降百分之四十至七十一，因此他们认为，土地处理工业废渣是一种和有效的处理方法 （ 6）食品保鲜包装物毒性检测应用： 2005 年 10 月，我国国家之间总局对聚氯乙烯食品保鲜膜使用安全问题，通过对市场上存在的 44 种聚氯乙烯的食品保鲜膜进行抽查，发现某些用聚氯乙烯单体制成的保鲜膜含有
23、对人体有害的增塑剂，而此前这类产品常用于超市包装新鲜 水果，蔬菜。熟食等，由此，食品包装膜的安全性引起了公共关注。有关于淡水发光菌 Q67 检测毒性的论文早有发表，但是将其用于检测人工高分子聚合物的毒性尚未见报道。有关人员通过淡水发光细菌毒性测试技术这一简单方法对市场上常见的食品保鲜包装材料进行生物毒性检验。可用毒性参比物5 酚类对发光菌的抑制情况与其样品进行比较。（ 苯酚类化合物在染料、炸药、农药等生产中具有重要的地位，其取代酚是重要的化工原料或中间体，它们对人体具有潜在的致癌性，这些化合物大多属于有毒有害物质，在水体环境中广泛存在，对水体生物的生长、发育和繁殖构成危 害，破坏了水体生态系统
24、。取代酚类化合物对环境的污染一直被人们所关注，美国、日本等国家把取代酚类列入环境中的重点污染物。 Konemann 指出：具有相似反应机制的化合物，混合毒性可通过浓度的增加来确定，并提出了混合毒性指数（ MTI），以此来评价多种化合物共存对水生生物的影响。Hermens 等人用此方法确定了 21 个非反应性有机化合物的混合毒性对生物发光的抑制。修瑞琴等报道了用联合效应相加指数（ AI）法研究污染物对水生生物的毒性作用。） 实验证明，市售的食品保鲜膜和保鲜袋在高温加热后将会对食品的安全性有一定的影响，因 此，要尽量避免在微波炉中用食品保鲜袋和保鲜膜包裹食品加热，或至少在食品加热时不要与食品直接接
25、触，然后将其与食品分离，越快越好 （ 7）在食品安全检测中的应用：猪，牛和奶牛内等动物在饲养时，可能会接触到抗生素或某些兽药，所用饲料，新鲜草料等也可能受到某些重金属的污染物。随着食物链的传递残留在动物体内，人通过食用便达到人体内，固然会影响人的健康，鲜肉或牛奶及奶制品极有必要做有没有污染毒性的检验。华东师范大学熊蔚蔚 15，朱文杰等人，以牛奶的安全检测为例，做了一系列的研究。该设计方案考虑了国家标准循序的浓度对发光 菌的毒性表现，注意到单一毒性和多种毒性共存的总毒性表现，客观的正确判断样品的食品安全。得出以下结论 :在蒸馏水和牛奶中重金属对发光菌的毒性不同，且水溶液中重金属的毒性远远大于牛奶
26、中重金属的毒性。通过构建牛奶安全性评价等级与 30min 徐昂对发光强度的关系，初步建立了发光菌牛奶实用安全性评价体系。 （ 8） 国内朱金国等人利用明亮发光杆菌，采用大量接种快速培养方法，制备出适宜检测用的发光菌检测液，建立了发光细菌检测四环素族抗生紊效价结果表明，在该检测体系条件下，明亮发光杆菌与金霉累、土霉素和四环素效价的抑制效应呈良好 的线性关系，菌液与抗生素的作用最佳体积配比为 l： 3，相互作用的适宜时间为 60至 80min。该体系对四环素族抗生索的检测灵敏度可达 0 00625 5ug/ml, 比传统的杯碟法高 5倍，具有快速：简便的特点，可作为食品中抗生素残留的一种快速、灵敏
27、的筛选检测方法。 A Kahru， K Tomoson,T Pall等人利用明亮发光杆菌冻千粉对广泛使用的 13种杀虫剂、除草剂和 14种溶剂，按 ,照 ,Biotox进行了测试，测试所得数据为 5min的 ECho值，结果发现毒性最大的杀虫剂是五氯苯酚 (EC50=55mg 1)，毒性最小的是百草枯 EC50=14800lm/l，所得数据同Microtox 方法、动物的半致死方法比较发现： Biotox方法与 Microtox方法的农药与溶剂，农药，溶剂的相关性分别是 0 78， 0 37， 0 95。同时。有些农药因为加有溶剂的关系会减弱农药的毒性，所以部分物质的数据采用 5min的 EC20值。 1.3.3 污染物联合毒性研究展望 混合污染物联合毒性研究始于 193916年，经过近 70 年的发展，已经成功发展了 Tu17 (毒性单位 )法 AI(加和指数 )法 18、 MTI(混合毒性指数 )法 19及入 (相似参数 )法 20。这些方法都能根据实验和相应公式的计算结果简单判别混合物的联合作用方式为拮抗、独立、相加及协同。然而，随着新化学品的不断问世及联合毒性的复杂性和多变性，越来越多科学研究者发现这些方法只能定
