1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 生物自显影法筛选白蔹酯提物抗菌活性 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 本实验研究了白蔹酯提物中是否有物质对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长起抑制作用，采用的方法是生物自显影法 ，该法具有高效，快速的特点，在牛肉膏蛋白胨培养基中加入经稀释的菌液，将其涂布在酯提物层析板上，层析板上的抗菌物质经展开后与其他物质分离开来，经培养后会出现无菌区域，层析板经噻唑蓝显色后成浅蓝色，而无菌区域则成无色，无色区域出现的地方即白蔹抗菌物质所在。 实验结果显示在薄层板的中上端部分出现白色无菌斑点，性状椭圆，规则一
2、致，与显色区域界线清晰，证实在该区域含抗菌物质。通过两种菌的结果显示，白蔹酯提物对以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阴性菌抑制作用较为明显。 关键词 :酯提物 生物自显影 薄层层析 II Bioautography Screening Ampelopsis antibacterial activity of Ethylacetate extract Abstract: In this study, Ampelopsis ester extractings was adopted to study whether there are substances inhibiting the growth
3、of e. coli or staphylococcus aureus . Bioautography which is efficient, quick characteristic employed to plan experiments, adding in beef anointed specially designed by dilute bacterium fluid， Will its coating in ester extractings from chromatography board, the launch of the antibacterial substance
4、esters extractings from with other not-as-bad, via coating after incubation can appear sterile area， Experimental results showed that there could be sterile white spots in the upper portion of the thin layer plate ,which were oval characters, rules consistent with the clear color boundaries, confirm
5、ed in the region containing antibacterial substances. By the results of the two bacteria, Ampelopsis ester extractings were the more obvious inhibition of Staphylococcus aureus as the representative of Gram-negative bacteria. Keywords: Ester extracting thin layer plate Bioautography目 录 摘要 （） Abstrac
6、t （） 1 绪论 （ 1） 1.1 选题的背景、意义 （ 1） 1.2 生物自显影法简介 （ 1 ） 1.3 生物自显影法分类 （ 2） 1.4 新型高效生物自显影技术 （ 3） 1.5 白蔹化学成分 （ 3 ） 1.6 展望 （ 4 ） 2 实验内容（ 5） 2.1 实验流程 （ 5） 2.2 分析方法（ 6） 2.3 实验内容（ 8） 3 结果与分析（ 10） 4 结论（ 12） 5 致谢（ 13） 参考文献 （ 14） 2 1 绪论 1.1 选题的背景、意义 从天然产物中筛选、分离和提取天然抗菌成分已成为天然防腐剂和新药研发等研究领域的热点，筛选得到的产物往往需要进行生物活性鉴定，传统
7、的鉴定方法需要在整个动物或者是器官上进行，这样不仅需要大量的活体实验体，还需要大量的目标提取物，实验过程复杂，操作要求高，无法满足实验要求，这样就使得我们去寻找并建立灵敏、方便、快捷且经济的活性检测方法，目前都采用微量生物活性物质的鉴定方法，如酶法 1，微生物抑菌法，免疫原法，生物自显影法等，其中生物自显影法又以其快 速，方便等特点成为生物活性物质检测与定性的首要选择。 1.2 生物自显影法简介 2 普通生物自显影技术是一种利用薄层色谱来对生物活性进行测定的方法，薄层色谱是一种分离色谱，他能将天然产物初提物中的活性成分和非活性成分在薄层板上很好的分离并展开，再通过与混合了微生物（各种真菌，致病
8、菌，病原微生物）的培养基相接触，通过一定的手段培养，培养基上会出现两个不同的区域，一个是被微生物覆盖的区域，即非活性区域，另一个出现抑菌圈的地方则是活性区域，相对薄层板上的展开位置就是生物活性物质的所在，通过洗脱剂可将其收集。 再参考该物质的标准展开样板，则可得知该物质的化学结构，分子式等信息。 1.3、 TLC生物自显影技术的分类 3 1.3.1 琼脂扩散法 琼脂扩散法是较早的一种生物自显影法，其操作步骤就是最原始的步骤，所需要注意的是，在实验过程中可在培养基中加入一定量的四挫盐（如 MTT， INT等），四挫盐本身颜色较浅，但是它在接触了微生物的代谢产物之后会变成深色，有助于我们的判断，还
9、有一点就是如果薄层板采用的是硅胶吸附剂，那么可以在硅胶和培养基之间放置一张湿润的滤纸，因为琼脂有粘性， 它与硅胶层接触后会产生黏着，会破坏抑 菌圈的观察。 1.3.2 直接 TLC生物自显影法 该法与上述方法的区别是它的载体由培养基变成了薄层板，用特制培养液培养细菌制成菌悬液，然后将菌悬液喷洒在展开完成的薄层板上，一定潮湿避光的条件下培养一定时间，同样加入一定量的四挫盐，但是该方法只适用于那些能在薄层板上很好生长的真菌类微生物。 1.3.3 琼脂覆盖法 琼脂覆盖法是上诉两种方法的综合，它是以薄层板为载体，但不是采用喷洒式，而是将融有菌的琼脂熔融液均匀覆盖到薄层板上，等到琼脂凝固后再在一定的条件
10、下培养，用四挫盐染色后，3 就可以观察到结果，该方法的优点是 实验过程对结果的影响较小，可以放心大胆的实验。 1.4、新型高效生物自显影技术 1.4.1 HPTLC生物自显影技术 高效薄层色谱（ HPTLC）生物自显影技术 4，他在薄层板的制作上加以改进，它采用粒度分布很窄的微粒硅剂（ 5-10um）制备高效薄层板，用程序多级展开或圆形展开技术使薄层色谱的灵敏度和分辨率大大提高。相对于 TLC色谱，他有以下优点：（ 1）分辨率提高，分辨率与吸附微粒的半径的平方成反比。（ 2）分析时间变短，展开速度与吸附剂颗粒半径成正比，故颗粒越小，展开速度越慢，但是由于分离效率大大提高，所以 分析时间还是变短
11、。（ 3）检出灵敏度增加。 1.4.2 二维生物自显影技术 所谓二维生物自显影技术就是一个薄层，两次展开 5的意思。先用极性展开剂将薄层板展开 , 调转 90后再用非极性展开剂第 2次展开 , 这样在一块薄层板上就同时展开了极性和非极性成分。相对于二维薄层色谱， TLC法有以下不足：一维薄层色谱不易将成分复杂的样品完全分离，致使抑菌斑点的归属不清；不能将活性成分完全从薄层板中转移至培养基中，尤其会影响含量较少和不易扩散活性成分的表达；活性成分扩散到培养基后，由于平板培养基较厚，活性成分可扩散的空间较 大，不易形成位置准确、轮廓清晰的抑菌斑点。 1.5、白蔹简介与化学成分 1.5.1 白蔹简介
12、白蔹 6又 名白根、猫儿卵 , 具有清热散结、生肌止痛功效 , 白蔹为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹 ( A m pelopsis japonica(Thunb.) Makino) 的块根。白蔹入药历史已久 ,早在名医别录中已有记载，是历代医家治疗疔痈的重要植物。近代临床报道其多用于治疗外科炎症 ,扭挫伤。 1.5.1 白蔹主要化学成分 （ 1）多酚类 多酚类是白蔹的主要化学成分，也是其主要活性物质。包括没食子酸， 1,2,6-三氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖， 1,2,3,6-四氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖， 1,2,4,6- 四氧 - 没食子酰基 - -D- 吡喃葡萄糖， 1,2
13、,3,4,6-五氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖，二聚没食子酸， 1,4,6-三氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖， 2,4,6- 三氧 - 没食子酰基 -D- 吡喃葡萄糖， 2,3,4,6- 四氧- 没食子酰基 -D- 吡喃葡萄糖， 6- 氧 - 二聚没食子酰基 -1,2,3-三氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖，槲皮素 -3-氧 - -L-吡喃鼠李糖，槲皮素 -3-氧 -(2- 氧 -没食子酰基 )- -L- 吡喃鼠李糖。这些多酚类物质有的具有较强的抗脂质过氧化活性，有的具有很强的抗毒肝素活性 7。 4 （ 2） 有机酸类 用硅胶柱层析从白蔹的乙醇提取物中分离得到脂肪酸三十烷
14、酸和二十八烷酸。 （ 3） 三萜、甾醇及其苷类 用硅胶柱层析从白蔹乙醇浸膏的乙酸乙酯提取物中分离得到 -谷甾醇、豆甾醇和豆甾醇 -D- 葡萄糖苷。 （ 4）其他 白蔹中的蒽醌类主要有大黄素甲醚、大黄酚和大黄素等。从白蔹的甲醇提取物中分离得到具有抗肿瘤活性的 momordins，包括 momordin I， Id 和 Ie。 白蔹中还含有卫茅醇、淀粉和黏液质 8等 1.5.3 白蔹乙酸乙酯提取物 俱赫军 9等人从白蔹的乙酸乙酯提取物中萃取分离到了 8种物质，分别鉴定为没食子酸 (1) 、原儿茶酸 (2) 、龙胆酸 (3) 、白藜芦醇 (4) 、大黄素 (5) 、羽扇豆醇 (6) 、 - 谷甾醇
15、(7) 、胡萝卜苷 (8) 。 1.6、发展前景 随着人类对化学药品危害的认识，天然生物药物已经逐渐崭露出蓬勃的趋势，所以，快速，简便，有效的分离方法也将在未来分离技术中占据着重要的位置，生物自显影技术虽然才发展了几十年，但由于其优越的性能与特点，已经成 为了生物分离技术的主攻点。掌握好生物自显影技术，并加以改善和精进，对人类健康，寿命，对社会稳定发展等都有其非凡的意义 。 5 2 实验内容 2.1 实验流程 本课题采用的是直接 TLC 生物自显影法，以完成展开的薄层板为载体，将含菌液的培养基涂布至上面。 实验流程如下： 菌种 菌种活化 试剂与仪器灭菌 制备菌悬液浓度梯度 确定最佳菌悬液浓度
16、白蔹酯提物的提取 酯提物层析，分离抗菌物质 薄层板培养 噻唑蓝溶液的配置 显色剂显色 抑菌圈大小与 Rf 值的测定 图 2-1 实验流程示意图 2.2 分析方法 白蔹 酯提物经展开剂展开后在薄层板上形成展开条带，将酯提物中的抗菌物质与其他物质分6 离开来，涂布上还有菌液的培养基之后，抗菌物质与培养基中的菌液会互相渗透，菌种就会在薄层板上生长，菌种的代谢产物也会留在薄层板上，而含有抗菌物质的区带就会因无法生长菌种，而不含菌代谢产物，从而无法与显色剂呈现显色反应，会在薄层板上出现斑点。 2.3 实验内容 （ 1） 菌种 的选择 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，菌种选取试验室储藏的群种，活性中等。 （ 2
17、）仪器的准备 试验过程需要的试剂与仪器 试剂：牛肉膏，蛋白胨， nacl，盐酸，硅胶，琼脂， 甲醇，氯仿，石油醚，丙酮， 95%乙醇，噻唑蓝。 仪器：锥形瓶 250ml 6 个，小试管 10 个，试管 2 个，培养皿 4 个，移液管 10ml， 2 支 托盘天平，烧杯若干，接种针，酒精灯，打火机，移液枪，棉花，玻璃棒，玻璃板，涂布棒。 表 2-1 实验涉及主要仪器 型号 名称 出厂商 FA1004型 电子分析天平 上海良平仪器仪表有限公司 SX2-4-10型 箱型电阻炉 嘉兴恒泰电热设备有限公司 SHP-150型 生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司 Cl-100型 双层铁皮电炉 浙江嘉兴凤桥
18、电热器厂 DSX-280A 灭菌锅 上海宜川仪表厂 DGX-9143B-1型 电热恒温鼓风干燥箱 上海福玛实验设备有限公司 （ 3）培养基的制备 由于试验选择的方式是 TLC 直接生物自显影法，所以制备的培养基要求琼脂含量较低，根据琼脂含量的不同制备两种培养基， 牛肉膏，蛋白胨， nacl，琼脂都选自实验室， 用电子天平称取牛肉膏 1.5g，蛋白胨 5.0g。 nacl 2.5g，水 500ml，每样各两份，放于锅中煮，称取琼脂 4.0g 与 8.0g 两份，剪碎，放置与锅中煮，变煮变搅拌，加水至 体积为 500 毫升左右，保证琼脂完全溶解，调 ph7.47.6，将起装至锥型瓶中，保证每瓶中培
19、养基含量为 150ml 以下，扎口备用。编号 1.2.3 与 A.B.C，其中数字类为琼脂含量低的培养基，用于以薄层板为载体的培养基涂布使用，字母类的为琼脂含量高的培养基，用于做试管斜面，与以培养皿为载体的培养基的制备。 7 （ 4）仪器的灭菌 收取 10 支小试管，洗净，晾干，用移液枪在每只试管里装 4.5ml 的水。并编号 1 到 10， 需要灭菌的仪器与试剂有，已分装培养基的锥形瓶，已装水的小试管，用报纸包好的培养皿4 个，试管 2 支，一盒移液 枪的枪头。 将上述所有物品放入高压蒸气灭菌锅，进行高压灭菌， 121 ，保持 30 分钟，待 压力磅指针回复到零位时，打开高压锅盖，待锅内温度
20、下降到 60 70C。取出，放置与超净台，备用。 （ 5）菌种活化 取字母类培养基，微波炉中火加热 2 分钟，置于超净台中，取已灭菌的试管两只，酒精棉擦拭手面，在每支试管中倒入约五分之一的培养基，架空头部使其形成菌种斜面，静止冷却使其凝固。 用接种针挑取稍微原菌样，在培养基斜面中划线，制成菌种斜面，编号大肠与金葡，放入培养箱中， 38倒置培养 8 小时。 （ 6）菌悬液的制备 取已 灭菌的小试管与枪头于超净台中备用，取出以活化的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌，用接种针在大肠菌落上挑取少许，在 1 号试管内摇匀，摇匀后用 500 微升移液枪移取 0.5ml 的菌液至2 号试管，换枪头后移取 0.5ml
21、 的群液至 3 号试管，同样的操作到 5 号试管为止，换菌样，挑去菌液到 6 号试管，同样操作到 10 号试管，这样就制备了菌液浓度为 10-5 的菌样，置于超净台中备用。 （ 7）白蔹酯提物溶液的制备的制备 选用实验室已提取的白蔹酯提物， （ 8）薄层板的制备 选取质量较好，表面平整的玻璃片 30% 的盐酸浸泡玻璃板 10min 自来水 冲洗洗 衣粉水浸泡 10min 自来水冲洗竖着放置烘干称取一定量的薄层层析硅胶加少量水 (2-2.5倍 )研磨均匀涂板平放，室温下自然干燥 100 度除水活化 1 小时用纸包好放入干燥器备用。 （ 9）展开剂的选择 展开剂的选择是该试验的重难点所在，取少量白蔹酯提物用甲醇溶解备用。 石油醚与丙酮配比 1:1，点样点 3，层析结束后发现除了起点与终点之外，在薄层板上未出现展开点。
