1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 青钱柳愈伤组织的诱导方法初探 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 摘 要 ： 本文讨论了青钱柳愈伤组织的诱导方法，目的在于 初步筛选青钱柳的诱导培养基，为青钱柳的大规模生产以及用于基因 工程育种打下坚实的基础。 在本 实验中以青钱柳茎段为试验试材 ,以 MS 为基本培养基 ,分别添加不同浓度的 BA 和 NAA 来确定最佳的诱导愈伤组织培养基。试验结果表明 :MS + BA 0.5mg/L + NAA 0.1mg/L 的固体培养基 ,有很好的诱导外植体产生愈伤组织的效果。 关键词 : 青钱柳；愈伤组织；培
2、养基；植物组织培养。 The Preliminary Exploration of the QingQianLiu callus Abstract: This paper discussed the QingQianLiu callus induction method, the purpose is to screen inductive medium of QingQianLiu, lay a solid foundation for QingQianLiu mass production and used for genetic engineering breeding. The exp
3、eriments were used the stem of QingQianLiu as test plant. The MS as culture medium were each added different concentration BA and NAA. The results of experiments: MS solid culture medium added BA 0.5mg/L and NAA 0.1mg/L had good induced effect to explanations growth callus. Keywords: QingQianLiu; ca
4、llus; medium; plant tissue culture. 目 录 摘要 .I ABSTRACT 1 绪论 . 错误 !未定义书签。 1.1 青钱柳 .1 1.1.1 生物学特性 .1 1.1.2 生长环境 .1 1.1.3 资源分布 .2 1.1.4 青钱柳繁殖技术 .2 1.1.5 开发利用前景与展望 .3 1.2 论文目标 .3 2 实验部分 .4 2.1 实验目的 .4 2.2 研究方法 .4 2.3 实验用品 .4 2.3.1 实验设备 .4 2.3.2 实验仪器 .4 2.3.3 实验材料 .4 2.3.4 其他用品 .4 2.4 MS 培养基 .4 2.4.1 培养基
5、母液的配制与保存 .4 2.4.2 配制培养液 .6 2.4.3 溶化琼脂 .6 2.4.4 调 PH.7 2.4.5 培养基的分装 .7 2.4.6 高压灭菌 .7 2.5 实验步骤 .7 2.5.1 选取外植体 .7 2.5.2 外植体的消毒 .7 2.5.3 接种 .8 2.5.4 培养 .8 3 实验结果 .10 4 实验讨论 .12 4.1 青钱柳植物组织培养中对植物激素的选择 12 4.2 青钱柳植物组织培养的培养基配方及培养条件的选择 12 致 谢 . .13 参考文献 . 14 1 1 绪论 1.1 青钱柳 1.1 .1 生物学特性 青钱柳 (QingQianLiu)又名铜钱树
6、、摇钱树，为胡桃科青钱柳属植物，该属仅有青钱柳一种，是集用材、绿化、茶饮保健、药用治疗于一身的珍稀树种。其树形象柳树，果实如古铜钱，约 10 个果实串生在一起，层层叠叠，颜色碧绿，故名“青钱柳”（如图 1-1,图 1-2 所示）。叶为单数羽状复叶，小叶 7 9 片，革质。花期 3 4月，单性，雌 雄同株，雄柔荑花序 2 4 条成 1 束集生在短总梗上，雌柔荑花序单独顶生。果序轴长 25 30 厘米，果实有革质水平圆盘状翅，顶端有 4 枚宿存花被片及花柱。 10 月果实由青转黄时采摘，去翅混砂贮藏。冬播或春播，种子外壳坚硬，播种前需用温水浸种2 3 天，每斤种子 2800 粒左右，每亩播种约 2
7、0 斤。 图 1-1 青钱柳叶 我国从 1970 年开始对青钱柳进行药用开发研 究，结果表明，青钱柳具有明显的降血糖、降血压、减肥、抗肿瘤、抗衰老、抗过敏、清热解暑、提高人体免疫力、促进新陈代谢等多种功效，尤其对治疗糖尿病有显著疗效。青钱柳叶含有丰富的矿质营养素，在水中可溶解 10% 以上的元素有钾、镁、锌、锰、硒、镍、铜和锂，能有效地降低血糖和尿糖，可治疗糖尿病。 1.1.2 生长环境 图 青钱柳树大喜光，幼苗稍耐阴，喜生于温暖、湿润、肥沃、排水良好的酸性红壤或 黄红壤。适生于湿度较大的环境 ,在土壤干旱瘠薄的地方生长不良。青钱柳根系发达，每年有大量的凋谢物，分解速率高，是良好的肥料树种，与
8、常绿针叶树种混合造林后，可改善土壤结构，提高土壤肥力，并能充分发挥涵养水源的功能。青钱柳常与银鹊树、大叶楠、青冈、紫楠、浙江柿、香槐、柳杉等混生，组成常绿与落叶阔叶混交林群落。 图 1-2 青钱柳叶 2 1.1.3 资源分布 青钱柳产于长江以南，分布范围很广，南至 华南，东达台湾，西至西南，多生于海拔 4202500m 的山区、溪谷、林缘、林内或石灰岩山地，主要分布在安徽、江西、江苏、浙江、台湾、湖北、湖南、四川、贵州、广西、广东和云南等地， 常集中分布在海拔 400 800m 的山地阔叶林中。 1.1.4 青钱柳繁殖技术 青钱柳是我国重点保护的濒危植物之一，具有很高的开发应用价值。但是，现有
9、的青钱柳资源主要是天然林，不仅数量少，而且多零星分布于深山老林和一些自然保护区中。目前，国内外尚无大量人工繁殖和栽培青钱柳的成功经验，影响了青钱柳的开发利用和产业化进程。青钱柳资源的人工 培育问题十分重要，对青钱柳繁殖技术研究的探索主要包括有性繁殖和无性繁殖。 （ 1） 有性繁殖 青钱柳的繁殖以有性繁殖为主。 10 月果实由青转黄时采摘，去种翅后混沙贮藏，冬播或春播均可。青钱柳种子具有深休眠的特性，一般播种后需隔年甚至 2 年才能萌发，自然发芽率低，仅为 0.1% 0.2%，天然状态下，这一生殖障碍可能是导致青钱柳致濒的主要原因。但人工处理可以大提高种子的发芽率，并打破深休眠，提早发芽。史晓华
10、等研究指出：青钱柳种子坚硬外壳是导致其强迫休眠的主要原因，它既束缚了种胚，又影响了透气性，但仍具有透水性；其次，种 子还存在着生理休眠。杨万霞认为青钱柳种子属于综合性深休眠类型，种皮在一定程度上阻碍了胚与外界的水气交换；同时，种皮内积累了大量的抑制物质，使幼胚进入深度休眠状态。因此，在有性繁殖方面，种子发芽技术一直是研究的重点和难点。尚旭岚等采用离体胚培养技术使种子很快萌发并在短期内迅速成苗，这种无菌苗经炼苗移栽 1 个月后均能成活，大大缩短了发芽时间。 近几年来众多学者对其进行了研究，人们除了对种子进行湿沙埋藏与温水浸泡等催芽外，还对种子采用低温层积、酸蚀和赤霉素处理，以提高种子的发芽率，缩
11、短育苗周期。史晓华、方升佐等利用 酸蚀种子，湿沙层积一冬，萌发温度 25，发芽率达到 87.15 %。宋祖祥等采用赤霉素处理种子，不仅能提高种子出苗率，还能有效缩短育苗周期。 （ 2） 无性繁殖 无性繁殖由于它能保持繁殖母体的遗传性，可以克服某些树种因种子休眠等问题而带来的一系列困难，所以长期以来一直被广泛采用。由于青钱柳种子发育差，自然更新能力弱，且大多呈零星分布，利用无性繁殖技术扩大其种群数量就显得格外重要。 迄今为止，有关青钱柳无性繁殖方面的研究主要有扦插、组织培养和离体胚的培养。扦插。3 青钱柳属难生根树种。宋祖祥自 1993年开始对青 钱柳的扦插繁育进行了大量的试验，但扦插成活率近于
12、零；夏小华等采用 ABT生根粉处理，扦插成活率仅为 2%，用 QI生根粉处理，扦插成活率为 16%，用 QInc生根粉处理的扦插成活率最高，可达到 41%。郭春兰等用 SJcl处理插穗，生根率达到了 45.6%。对生产应用而言，这种扦插成活率还是偏低。须继续加强生根调节剂种类、浓度、配比、母树年龄、枝条发育程度及外界环境条件等影响因子的系统研究，优化出提高扦插成活率的配套措施。组织培养。胡冬南等以青钱柳一年生枝条的茎段为外植体，诱导出愈伤组织，但其进一步研究的效果不理想。基 本培养基种类是影响青钱柳离体胚萌发和成苗最关键的因素，在萌发和成苗两个阶段都以 WPM为适宜基本培养基。此外，嫁接是植物
13、繁殖的重要方法之一，能保持植物的优良品种特性，增强植物对环境的适应能力。 1.1.5 开发利用前景与展望 青钱柳是我国独有的珍稀药用植物，含有无机成分、三萜类成分、黄酮类化合物、稀土元素等多种有效药用成分，具有降血糖、降血脂、降血压、调节胆固醇、增强免疫能力等多种药用价值。 以无毒、安全、热量低、品质优又具有保健作用的天然甜味剂来代替蔗糖和人工合成的甜味剂，是国内外开发利用的热点，也 是科技工作者迫切需要解决的大课题，青钱柳中所含的天然甜味剂，是满足这一需求的理想成分，具有重要的开发利用价值。 硒与维生素 E结合是一种重要的体内自由基清除剂，青钱柳的抗氧化、抗衰老作用可能与之密切相关，可开发一
14、些以青钱柳为原料的新型营养保健品和药物剂型。 加强对青钱柳人工资源的培育具有重要的经济价值和生态意义。就青钱柳人工资源培育来看，有性繁殖的技术研究已达到一定水平，如休眠的打破，休眠机制应继续深入研究；无性繁殖技术还有待于进一步研究，如扦插、嫁接技术，特别是组织培养技术，它是工厂化育苗的重要措施，也是科 研工作的重要辅助手段，必将是今后的研究重点之一，可为今后青钱柳的开发利用和产业化经营提供依据。 1.2 论文目标 选择适当的外植体； 选择适当的愈伤组织培养基； 得到再生植株； 筛选出适宜的青钱柳诱导培养基。 4 2 实验部分 2.1 实验目的 初步筛选青钱柳的诱导培养基，为青钱柳的大规模生产以
15、及用于基因工程育种打下坚实的 基础。 2.2 研究方法 选择适当的外植体； 选择适当的愈伤组织培养培养基； 得到再生植株； 筛选出适宜的青钱柳诱导培养基。 植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，指从植物体 分离出符合需要的组织、器官或细胞， 原生质体 等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整 植株 或生产具有经济价值的其他产品的技术。 2.3 实验用品 2.3.1 实验设备 高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、电炉 2.3.2 实验仪器 培养皿、电子天平、试剂瓶、无色瓶、棕色瓶、镊子、剪刀 、玻璃棒、酒精灯、刀片、 PH试纸 2.3.3 实验材料 青钱柳嫩叶，嫩
16、芽 2.3.4 其他用品 乳胶手套、一次性 PE 手套、棉球、保鲜膜、组织培养封口膜、报纸、结绳 2.4 MS 培养基 植物组织培养中常用的一种培养基是 MS 培养基。 MS 培养基的配制包括以下步骤。 2.4.1 培养基母液的配制和保存 MS 培养基含有近 30 种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的 20 倍或 200 倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的 1/20(50 mL)或 1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。 5 大量元
17、素 (母液 ) mg L NH4NO3 33000 KNO3 38000 CaCl22H2O 8800 MgSO47H2O 7400 KH2PO4 3400 微量元素 (母液 ) KI 166 H3BO3 1240 MnSO44H2O 4460 ZnSO47H2O 1720 Na2MoO42H2O 50 CuSO45H2O 5 CoCl26H2O 5 铁盐 (母液 ) FeSO47H2O 5560 Na2-EDTA2H2O 7460 有机成分 (母液 ) A 肌醇 20000 B 烟酸 100 盐酸吡哆醇 (维生素 B6) 100 盐酸硫胺素 (维生素 B1) 100 甘氨酸 400 6 以上
18、各种营养成分的用量，除了母液 为 20 倍浓缩液外，其余的均为 200 倍浓缩液。 上述几种母液都要单独配成 1L 的贮备液。其中，母液 、母液 及母液 的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到 1L。 母液 的配制方法是：将称好的 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA2H2O 分别放到 450 mL 蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将 pH 调至 5.5，最后定容到 1L，保存在棕色玻璃瓶中。 各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存 在冰箱的冷藏室中。 M
19、S 培养基中还需要加入 2， 4-二氯苯氧乙酸 (2， 4-D)、萘乙酸 (NAA)、 6-苄基嘌呤 (6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液 (0.1 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这 3 种物质各 10 mg，将 2， 4-D 和 NAA 用少量 (1mL)无水乙醇预溶，将 6BA 用少量 (1mL)的物质的量浓度为 0.1mol/L 的NaOH 溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至 100mL，即得质量浓度为 0.1mg/mL 的母液。 2.4.2 配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母 液 为 50 mL，母液 、 、 A 和 B 各 5mL
20、。再取 2， 4-D 5mL、 NAA1mL，与各种母液一起放入烧杯中。 配制培养液时应注意： 在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制； 用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗 2 次； 量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取 1 种，划掉 1 种，以免出错。 2.4.3 溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂 9g、蒸糖 30g，放 入 1000mL 的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水 750mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至 1000mL，搅拌均匀。 需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。
