1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 水稻愈伤组织的诱导 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 1 水稻组织 培养 摘要 ： 水稻组织培养技术在生物技术的研究中已经被广泛应用了。在这篇论文中，我们采用水稻种子作为外植体在培养基中进行 水稻繁殖。在未来研究中，我们将继续增加诱导频率，以期更 好的利用于 转基因研究 上。 关键词 ： 水稻； 外植体 ；组织培养 The rice tissue culture Abstract: The rice tissue culture technique has been widely used in bio
2、technique research.In this report，we use rice seed as explants to determine the medium for rice generation culture .In further research ，we will continue to improve the induction frequency and make it better use on the rice transformation research. Keywords: rice; Tissue culture; explants 2 目 录 摘 要
3、. 1 Abstract . 1 1 绪论 . 1 1.1 关于水稻愈伤组织的简介 . 1 1.2 组织培养 . 1 1.3 愈伤组织的形成 . 2 1.4 水稻愈伤组织的诱导 . 2 1.5 目前水稻组织培养中存在的问题 . 3 1.6 论文目标 . 3 1.7 相关研究的最新成果及动态 . 4 2 实验部分 . 6 2.1 实验流程 . 6 2.2 实验设备和材料 . 6 2.2.1 实验设备 . 6 2.2.2 实验材料 . 6 2.2.3 实验试剂 . 6 2.3 实验内容 . 8 2.3.1 配制培养基 . 8 2.3.2 消毒 . 10 2.3.3 水稻愈伤组织培养 . 10 3
4、结果与分析 . 11 3.1 不同激素浓度对水稻愈伤组织生长的影响 . 11 3.2 不同浓度激素对水稻愈伤组织分化的影响 . 13 致 谢 . 错误 !未定义书签。 参考文献 . 16 1 1 绪论 1.1 关于水稻愈伤组织的简介 水稻是人们重要的食粮之一，由于其基因组小，通过组织培养易获得再生植株等特点而在基因克隆、基因功能验证以及遗传转化等研究方面成为模式植物。生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织细胞培养是获得转基因植物的最好来源。因此，建立一个高效再生体系是实现基因转化的先决条件 1。近年来，研究者先后从水稻各部位诱导出愈伤组织和再生植株。虽然，幼穗、幼胚、花粉粒、花药愈伤组织诱导率高，愈伤组
5、织质量好而受到青睐被广泛用于水稻的遗传转化、品种培育中 2-3。但上述材料多受季节限制，取材不 便，阻碍了水稻组织培养的进一步发展 。 1.2 组织培养 所谓的植物组织培养是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基对离体的植物器官组织细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株 的技术 4。 其研究的类型主要包括组织培养、器官培养、细胞培养、及原生质体培养。随着研究 T作的深入进展，上述 5个方面的研究理论和技术体系逐渐得到完善促使植物组织培养的应用范围日益广阔延伸。组织培养作为一种育种技术在水稻等重要粮食作物已广泛应用，并培育出一大批优良品种，自 1965年我国开展水稻细胞培养研究
6、后，研究 者以水稻幼穗、幼胚、花粉粒和花药为材料进行组织培养研究，取得了较大的进展，尤其是建立起来的水稻胚性悬浮细胞系可作为基闪枪的理想受体，在水稻的遗传转化，品种培育巾具有重要作用。 再如细胞次生代谢物的生产，即通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物，如生物碱、抗菌剂、利血平、橡胶、类同醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质。远源杂种植物的产生，是指由受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功。采用胚的早期离体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘杂交后代，从而育成新物种。植物的快速繁殖，是指 利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生
7、植株的方法。植物快速繁殖是植物组织培养技术在农业生产中应用最广泛，产生经济效益最大的研究领域，涉及的植物种类繁多，技术日益成熟并程序化，繁殖速度突破了植物自然繁殖的界限，成就了工厂育苗的梦想。 水稻种子成熟胚经诱导形成愈伤组织，进而分化成苗的报道十分常见。粳稻出愈率与分化率一般都要高于籼稻，现阶段多以粳稻为实验材料。为了提高水稻愈伤的出苗率，有采用干燥处理2 5，辐射处理 6，添加铜、银元素 7-8，添加脯氨酸 9，添加 MET(多效唑 )10和添加活性碳 11等方法 . 两种方法较费时，辐射处理方法还需要特定的仪器，而且这几种方法只是对特定品种的水稻有显著作用，并不适合任意品种的水稻。 植物
8、种质资源的离体保存，即从 20世纪 60年代开始，人们利用细胞和组织培养再生植株的技术，进行了离体保存种质的研究。种质资源离体保存是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。为了创造新的种质资源，组织培养及基因工程技术被广泛用于水稻育种研究，并取 得了显著成果，如现代生物技术育种过程中常作为外源基因的受体的愈伤组织，其质量的好坏及其分化植株能力的高低直接影响着水稻基因工程的进展和水稻种质资源的创新。在改善愈伤组织质量和提高植株再生能力方面，科学工作者也进行了大量研究并得到了一定的成果 12。目
9、前水稻的组织培养已在单倍体育种、诱变育种、体细胞杂交及遗传转化等方面得到应用。 1.3 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织 ，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在 静止状态。起动期是通过一些刺激因素 (如机械损伤、改变光照强度、增加氧等 )和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类
10、物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有 2， 4-二氯苯氧乙酸、 萘乙酸 、 吲哚乙酸 和细胞分裂素等。 分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。 外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的 不同而有很大差别。例如， 烟草 、 胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。 1.4 水稻愈伤组织的诱导 水稻成熟胚愈伤组织诱导中普遍采用的基本培养基
11、主要有 MS、 N6 和 B5 等培养基。培养温度一般为 2228 ， 25 左右最佳；光照强度为 1 5002 000 Lx，可以选用日光灯或白炽灯，光照3 时间 1012 h 或全黑暗培养均可， 1030 d 可诱导出愈伤组织。 在水稻成熟胚的愈伤组织诱导过程中，为了保持愈伤组织的高速生长，常用到生长素类和细胞分裂素类物质。其中 2， 4-D 是禾谷类作物愈伤组织诱导中唯一不可缺少的激素种类，其作用的适宜浓度范围为 0.55.0 mg/L，也有例外。在附加有 6.0 mg/L 2， 4-D和 0.5 mg/L KT 的 MS 培养基上诱导出了大量小麦幼胚胚性愈伤组织。在培养基中添加一定浓度
12、的 ABA，对抑制胚芽和根的生长有明显效果，且能显著提高成熟胚愈伤组织的诱导率， ABA 浓度为 2mg/L 时诱导率最高。当ABA 浓度大于 5mg/L 后，其愈伤诱导率开始下降 。 通常通过成熟胚诱导的初生愈伤组织并不适于悬浮细胞培养，一般需要 36 周的继代培养，改良愈伤组织的形态。为了获得松脆，小颗粒和快速生长愈伤组织细胞，也可以采用相对较短的继代周期或将大块愈伤组织夹碎摊平等物理手段。固体继代次数对细 胞悬浮系的建立至关重要。有研究表明，愈伤组织在固体培养基上继代 7 次后形成的悬浮系与继 2 次后形成的悬浮系相比，前者明显好于后者，适当地增加继代次数有利于愈伤组织细胞形态的改变。
13、1.5 目前水稻组织培养中存在的问题 在水稻组织培养方面，我国科学家已克服了一道道难关，但在发展中还存在一系列问题，有待进一步探索。例如在目前的技术水平下，对水稻细胞无性系还雉以进行定向诱变，直至目前还没弄清体细胞无性系变异的规律，给细胞无性系变异育种带来一定的困难 13。 水稻的愈伤组织是进行遗传转化改良水稻 品质的重要方法之一。但是长期继代培养引起愈伤组织再生能力衰退是一个已被很多学者所认识和重视的问题，针对其衰退的原因也有比较深入的生理生化研究 14-17，但笔者认为它仍是一个有待进一步研究攻关解决的问题。 在水稻的组织培养和器官培养中花药离体培养作为一种新的育种手段，在水稻育种中得到应
14、用。我国是世界上首先将水稻花培品种应用于生产的国家，现已育成一批优质高抗的水稻优良品种，并取得了较好的经济效益和社会效益。花药培养诱导出的单倍体，表现出双亲性状的各种重组类型，通过自然加倍或人工加倍，可以在当代获得稳 定得纯合二倍体，大大加快了育种速度。但在实际操作中，由于受培养基组分、材料的差异性以及培养环境的影响，往往获得的再生植株群体较小，使选择受到较大的限制 18。并且水稻花药培养会产生大量的白化苗，有的甚至达 80一 90，成为花药培养研究和育种的重要障碍，以上诸多原因都是水稻的组织和器官在离体培养的情况下，建立禾本科植物再生体系以及转基因育种中存在的问题。 1.6 论文目标 水稻是
15、人们重要的粮食作物之一，也是经典的模式植物。生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织细4 胞培养是获得转基因植物的最好来源。近年来，研究者先后从 水稻各部位诱导出愈伤组织和再生植株。虽然，幼穗、幼胚、花粉粒、花药愈伤组织诱导率高，愈伤组织质量好而受到青睐，但上述材料多受季节限制，取材不便，阻碍了水稻组织培养的进一步发展。 本实验 以 本省粳稻种子为材料，对其在不同培养基条件下的出愈率及愈伤组织状态进行研究，以期获得状态较好的愈伤组织，为进一步利用其进行悬浮细胞培养及转基因研究提供理论及实验依据。 1.7 相关研究的最新成果及动态 自 1965年我国开展水稻细胞培养研究后，研究者以水稻幼穗、幼胚、花粉粒和花
16、药为材料进行组织培养研究，取得了较大的进 展，尤其是建立起来的水稻胚性悬浮细胞系可作为基闪枪的理想受体，在水稻的遗传转化，品种培育巾具有重要作用。 再如细胞次生代谢物的生产，即通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物，如生物碱、抗菌剂、利血平、橡胶、类同醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质。远源杂种植物的产生，是指由受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功。采用胚的早期离体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘杂交后代，从而育成新物种。植物的快速繁殖，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大 量再生植株的方法。植物快速繁殖是植物组织培养
17、技术在农业生产中应用最广泛，产生经济效益最大的研究领域，涉及的植物种类繁多，技术日益成熟并程序化，繁殖速度突破了植物自然繁殖的界限，成就了工厂育苗的梦想。 植物种质资源的离体保存，即从 20世纪 60年代开始，人们利用细胞和组织培养再生植株的技术，进行了离体保存种质的研究。种质资源离体保存是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。为了创造新的种质资源，组织培养及基因工 程技术被广泛用于水稻育种研究，并取得了显著成果，如现代生物技术育种过程中常作为外源基因的受体的愈伤组织，其质量的好坏及其分化植
18、株能力的高低直接影响着水稻基因工程的进展和水稻种质资源的创新。在改善愈伤组织质量和提高植株再生能力方面，科学工作者也进行了大量研究并得到了一定的成果。目前水稻的组织培养已在单倍体育种、诱变育种、体细胞杂交及遗传转化等方面得到应用。 5 6 2 实验部分 2.1 实验流程 将去壳种子进行消毒，然后接种于 NB培养基中诱导愈伤组织 挑选颗粒状小愈伤组织于 MS培养基中，进行 分化 培养 (3)获得具有良好的再生能力的胚性愈伤组织 2.2 实验设备和材料 2.2.1 实验设备 QYC 211 摇床；上海福玛实验设备有限公司 2.2.2 AL204 电子天平；梅特勒 -托利多仪器（上海）有限公司 DZ
19、F-6050 真空干燥箱；上海精宏实验设备有限公司 YXQ-LS-SH 全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅；上海博迅实业有限公司医疗设备厂 2.2.2 实验材料 春江早 6 号 来自于中国水稻研究所 2.2.3 实验试剂 NB 培养基母液（成分、浓度如表 1） 表 1 MS培养基母液成分、浓度 成分 使用浓度 (mg/L) 大量元素 硝酸钾 KNO3 200 硝酸铵 NH4NO3 480 硝酸钙 Ca(NO3)2.4H2O 470 氯化钾 KCl 150 磷酸二氢钾 KH2PO4 550 硫酸镁 MgSO4.7H2O 250 微量元素 硼酸 H3BO3 0.5 硫酸锰 MnSO4.4H2O 3.0
20、7 硫酸锌 ZnSO4.7 H2O 0.5 钼酸钠 Na2MoO4.2 H2O 0.025 硫酸铜 CuSO4.5 H2O 0.025 氯化钴 CoCl2 0.025 浓硫酸 Concentrated H2SO4 0.5 l 铁盐 乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA 37.3 硫酸亚铁 FeSO4.7H2O 27.8 有机成分 肌醇 Myo-inositol 100 盐酸硫胺素 Thiamin HCl VB1 1.0 盐酸吡哆醇 Pyridoxin HCl VB6 1.0 烟酸 Nicotinic acid VB5或 VPP 1.0 泛酸钙 Calcium pantothenate 1.0 腺嘌呤 Adenine 1.0 L-半 胱氨酸 L-cysteine 1.0 生物素 D-biotin 0.1 其他 蔗糖 sucrose g/L 琼脂 agar g/L MS培养基母液（成分浓度如表 2） 表 2 MS培养基母液成分、浓度 成分 使用浓度 (mg/L) 大量元素 NH4NO3 33000 KNO3 38000 CaCl22H2O 8800 MgSO47H2O 3400 KH2PO4 550 微量元素 KI 166 H3BO3 1240
