1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 白蔹三种不同萃取物的抗肿瘤活性研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 摘要 : 目的 研究白蔹三种萃取物（白蔹的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物）的体外抗肿瘤作用，并比较这 三种白蔹萃取物之间的抗肿瘤效果。方法 体外培养人宫颈瘤 Hela细胞，将其与各萃取物的不同浓度组共育，设白蔹三种萃取物的不同浓度组、 0剂量药物为阳性组合、空白对照组，采用四甲基偶氮唑盐（ MTT）比色法，测定白蔹三种萃取物对 Hela细胞的抑制率。结果 白蔹的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物的半抑制浓度分别为4
2、48.17mg L-1、 44.49mg L-1、 235.83mg L-1 。 结论 白蔹的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物对体外培养的 Hela细胞都具有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯萃取物的抗肿瘤作用最 好，正丁醇萃取物次之，石油醚萃取物的抗肿瘤作用最小。 关键词 : 白蔹；抗肿瘤；人宫颈癌细胞； MTT比色分析法 Study on Antitumor Activity of three extracts of Ampelopsis japonica(Thunb.)Makino Abstract: Objective To investigate the anti-tumor activit
3、y of the three extracts of Ampelopsis japonica(Thunb.)Makino.and to compare the inhibition effect of three extracts. Methods Cervix cancer Hela cells were cultured in vitro and then different concentration of three extracts of Ampelopsis japonica(Thunb.)Makino were added to Hela cells. Using differe
4、nt concentration of the three extracts ,control group of masculine , control blank group. The cytotoxic effects of the three extracts of Ampelopsis japonica(Thunb.)Makino on human cervix cancer Hela cells were tested by MTT assay. Results IC50 of these cells reached 448.17mg L-1、 44.49mg L-1 and 235
5、.83 mg L-1 ,respectively when exposed to three extracts. Conclusion The three extracts of Ampelopsis japonica(Thunb.)Makino have obvious inhibition effect on Hela cells. Ethyl acetate extract of the anti-tumor effect of the best, followed by Butanol extract, petroleum ether extract of the anti-tumor
6、 effect of the minimum. Keywords: Ampelopsis japonica(Thunb.)Makino; anti-tumor activity ; cervix cancer Hela cells; MTT assay 目 录 摘要 Abstract 1 绪论（ 1） 1.1 介绍（ 1） 1.1.1 选题的背景（ 1） 1.1.2 选题的意义 （ 1） 1.2 相关研究的最新成果及动态（ 1） 1.2.1 白蔹化学成分研究进展（ 1） 1.2.2 白蔹在药理方面的作用（ 2） 1.2.3 白蔹在临床方面的作用（ 3） 2 实验部分 （ 4） 2.1 实验材料
7、 （ 4） 2.1.1 原材料（ 4） 2.1.2 主要试剂和耗材（ 4） 2.1.3 实验仪器（ 4） 2.2 实验流程（ 4） 2.3 实验内容（ 6） 2.3.1 细胞复苏（ 6） 2.3.2 细胞培养（ 6） 2.3.3 细胞冻存（ 6） 2.3.4 细胞毒性检测 （ 6） 2.4 分析方法 （ 7） 3 结果与分析 （ 8） 3.1 白蔹萃取物对 Hela细胞的抑制作用（ 8） 3.1.1 白蔹的石油醚萃取物对 Hela 细胞 的抑制作用（ 8） 3.1.2 白蔹的乙酸乙酯萃取物 对 Hela 细胞的抑制作用 （ 9） 3.1.3 白蔹的正丁醇萃取物对 Hela 细胞 的抑制作用 （
8、 10） 3.2 白蔹的各萃取物对 Hela 细胞 的抑制作用比较 （ 12） 4 结论 （ 13） 致谢 （ 14） 参考文献 （ 15） 1 1 绪论 1.1 介 绍 1.1.1 选题的背景 白蔹又名白根 ,五爪藤 ,山地瓜 ,为蛇葡萄属植物。始载于神农本草经 ,性微寒 ,味苦 1。中华人民共和国药典 2005版收载的白蔹为葡萄科白蔹 Ampelopsis japonica( Thunb. )Makino 的块根 2。 白蔹原产我国的华北、华东和中南等省区，喜温暖湿润和阳光充足的环境，也耐荫，耐贫瘠和干旱，耐寒冷，但怕积水。白蔹块状茎具有清热解毒、消痈散结、生肌止痛之功效，可用于治疗痈肿疮
9、疡、瘰疬、烫伤、扭挫伤等 ;外用也可用于痈、疖、蜂窝组织炎、淋巴结炎等病症，常作药用植物栽培，近年将其作为观赏花卉引种栽培 3。 白蔹入药历史悠久 ,早在名医别录中已有记载 ,是历代医 家治疗疔痈的重要药物 4-5。 20 世纪 80 年代以前，对蛇葡萄属进行深入研究的文献报道甚少。近年来的研究发现，该属植物具有多方面显著的药理活性，引起了国内外学者的普遍关注 6。白蔹（ Ampelopsis japonica(Thunb.)Makino）作为葡萄科蛇葡萄属植物的唯一一个作为常用药使用的中草药，其主要活性为抗菌性 ,许多新活性如免疫调节活性及抑制毛发生长作用等不断被发现。抗肿瘤活性尤其值得关注
10、。韩国学者 7研究证明：白蔹中提取的 momordins 对 AP-1活性及肿瘤细胞的增生有抑制作用。 1.1.2 选题的意义 目前，从植物中寻求抗肿瘤活性物质现已成为抗癌药物的重要研究内容 8。例如紫杉醇、黄连、升麻等中药化合物，在临床上已经广泛被使用。本次实验研究白蔹的抗肿瘤活性，其相关方面的研究甚少。近年来 ，所见的研究大多数是从氯仿、乙酸乙酯等溶剂中萃取分离白蔹中的化合物，对白蔹的石油醚萃取物、乙酸乙脂萃取物、正丁醇萃取物的抗肿瘤活性研究仍待进一步的研究 。因此，本次实验的开展一方面为白蔹各种剂型的开发提供理论依据，另一方面，也为进一步探索白蔹的药理活性打下基础。 1.2 相关研究的最
11、新成果及动态 1.2.1 白蔹化学成分研究进展 现代研究发现，白蔹经 5乙醇渗漉提取后根据理化性质及光谱分析鉴定其化学成分为大黄2 素甲醚、羽扇豆醇、 p-谷甾醇、大黄酚、碳十六酸、大黄素、富马酸、胡萝卜甙、没食子酸、卫茅醇。大黄素甲醚、大黄酚、大黄素、富马酸、没食子酸具有抗菌和抗真菌作用，这与中医药关于白蔹的临床应用相一致 9。 为了进一步阐明白蔹的化学成分，为白蔹的深层开发提供依据，郝军等 10从白蔹的乙酸乙酯萃取液中分离得到了 8 个化合物。利用理化常数和波谱学方法 (1H NMR、 13C-NMR)鉴定了它们的结构，分别 为没食子酸、原儿茶酸、龙胆酸、白藜芦醇、大黄素、羽扇豆醇、 p
12、一谷甾醇、胡萝卜甙。 郝军等 2又从其氯仿和乙酸乙酯萃取部分中分离得到了五味子苷 、大黄酚 、大黄素甲醚、大黄素 -8-O- -D-吡喃葡萄糖苷 、 poriferast-5-en-3、 7 -diol、棕榈酸、齐墩果酸。目前所见的研究大多数是从氯仿、乙酸乙酯等溶剂中萃取分离白蔹中的化合物。 1.2.2 白蔹在药理方面的作用 (1)抗菌活性 抗菌是白蔹的主要活性，目前研究的较多。白蔹含有大黄素甲醚、大黄酚、大黄素、富马酸、没食子酸等多种抗细菌和 真菌成分，与其临床应用相一致。白蔹的水浸液对同心性毛癣菌、奥杜盎氏小芽胞癣菌、腹股沟和红色表皮癣菌等真菌有不同程度的抑制作用。水煎剂用平板稀释法对金黄
13、色葡萄球菌有抑制作用 11。 将蛇葡萄根、白蔹等 4味中药的 70% 乙醇提取物制成外用蛇葡萄根霜剂，体外抑菌实验表明，此霜剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌有不同程度的抑制作用 10。口腔微生物通过腐败消化口腔内的滞留物质产生挥发性硫化物及其它异味物质导致口臭。朱彩莲等 11通过测定挥发性硫化物，发现白蔹对临床采集的牙周病口臭患者唾液细菌的抑菌率为 45%。 (2)抗肿瘤 白蔹的甲醇提取物及从中提取纯化的 momordin对激活蛋白（ AP-1）活性及肿瘤细胞的增生有抑制作用。 momordin 对肿瘤细胞的抑制活性最强，其 IC50 为 22.8 mg/ml。白蔹的甲醇提取物和 m
14、omordin还对人肿瘤细胞有细胞毒作用， momordinI 细胞毒作用最强， IC50 为 7.28016.05 mg/ml7、 12。 Kim 等 11研究了 MomordinI 对白血病 HL-60 细胞的细胞毒作用，其 IC50 为 19.0 mg/ml，并证明其作用机制是通过降低 Bcl-2:Bax的比例及激活 caspase-3，诱导了白血病 HL-60 细胞的凋亡。 3 许多中药乙醇提取物均有高度酪氨酸酶抑制作用，能阻截皮肤中黑色素的形成。唐海谊等 11发现，白蔹水提物对酪氨酸酶有很强的抑制作用。 (3)免疫调节活性 动物实验表明 13， 3 种不同剂量的白蔹醇提物（ 5， 1
15、0， 20 g/kg）对小鼠外周血淋巴细胞 ANAE阳性率、 T细胞增殖能力及巨噬细胞吞噬功能均有促进作用，并随剂量增加作用增强，量效呈正相关。作者认为，白蔹提取物可增强小鼠 T淋巴细胞和巨噬细胞的免疫功能，表明白蔹的抗菌作用 与其免疫活性有关，临床用于抗感染治疗可能具有直接抗菌和调节集体免疫功能的双重机制。 (4)兴奋作用 赵翠兰 11观察了白蔹煎剂对小鼠给药前后电刺激的痛阈变化，发现白蔹煎剂对小白鼠有一定的兴奋作用，无镇痛作用。 (5)抑制毛发生长 白蔹的水煎剂对小鼠触须毛囊生长有明显抑制作用。 1.2.3 白蔹在临床方面的作用 白蔹属于清热解毒药，苦辛微寒，归心、胃、肝经。苦寒能清热解毒
16、，味辛能散结消痛，外用可敛疮生肌，可用于疮痈肿毒、烧烫伤。既可内服，又可外敷。 白蔹的临床应用有治疗癌性发热，治疗支气管扩张咯血，治疗 手足皲裂，治疗烧伤，治疗骨折等。 4 2 实验部分 2.1 实验材料 2.1.1 原材料 Hela 细胞（人宫颈癌细胞）：由华东师范大学生命医学研究所提供。 白蔹的石油醚萃取物、乙酸乙脂萃取物、正丁醇萃取物：由嘉兴学院朱红薇老师提供。 2.1.2 主要试剂和耗材 RPMI1640 培养基（美国 Hyclone 公司）； RPMI1640 双抗 （青霉素、链霉素） 溶液 （ Sigma）；DMSO 溶液（ Sigma）； PBS 缓冲溶液 (BOSTER)； 0
17、.25%胰酶溶液 （ Hyclone)；新 生胎牛血清（四季青）； 96 孔细胞培养板 (NEST,PLT-96) 四甲基偶氮唑盐 ( MTT , 美国 Amresco 公司 )母液配置： 50mg 溶于 0.01mol/ L PBS 缓冲溶液10ml, 配成 5mg/ mL 浓度 ,过滤除菌 , 4避光保存。现配现用。 RPMI1640 完全培养基：在 50mL 离心管中加入 10%终体积的灭活新生胎牛血清后，再加入1%终体积的 双抗溶液 ，最后加入 RPMI1640 培养基至终体积。 2.1.3 实验仪器 表 2-1 实验仪器 型号 仪器 厂址 AL-204 电子天平 梅特勒 -托 利多仪
18、器上海有限公司 MCO-20AZC 二氧化碳培养箱 日本三洋 DK-524 电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 XB-K-25 血球计数板 上海安信光学仪器制造有限公司 430290 50mL离心管 美国 Corning TCD-35 35mm细胞培养皿 NEST TS-100F 倒置生物显微镜 Nikon Model 680 全自动酶标仪 美国 BioRad 公司 U410-86 超低温冰箱 上海福玛实验设备有限公司 2.2 实验流程 5 人宫颈癌 Hela 细胞 细胞培养 传代培养 单细胞悬液 细胞冻存 传代培养 细胞接板 （待细胞贴壁后） 细胞复苏 加化合物 （加化合物 24 小时） 加 MTT （避光 37孵育 4 小时） （加入 150DL DMSO 溶解） 置酶标仪上于 490 nm 波长处测各孔 OD 值 图 2-1 日常细胞培养和细胞毒性测定实验流程图
