1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 不同来源 SOD 性质比较 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要： 超氧化物岐化酶 (Superoxide dismutase，简称 SOD)作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内 多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。本实验主要从大肠杆菌中分离纯化其发酵产生的 SOD， 同时 采用两次丙酮沉淀法和热处理工艺提纯猪血 SOD，并 通过邻苯三酚法测定其活性，最后用考马斯亮蓝法测其蛋白浓度，得到比活为 8154U/mg 的 SOD 蛋白。二者在耐热性、热稳定性等方面有不同的性质
2、 。 关键词： 超氧化物歧化酶；邻苯三酚法；分离纯化 II 不同来源 SOD 性质的比较 Abstract: Superoxide dismutase (SOD) acts as a free radical scavenger in a living organism. It can remove extra superoxide anion in human body, so that plays an important role in defending oxidative damage. In this study we purified the recombinant SOD ex
3、pressed in E.coil.At zhe same time, acetone precipitation and heat treatment process are used to purification SOD.The specific activity of the final product was 8154U/mg, which was determined by activity test and protein concentration measurement. The stability experiment showed that the purified SO
4、D protein had relative high thermo stability and so on. Keywords: Superoxide dismutase； pyrogallic acid； purification 目 录 中文摘要 （ ） 英文摘要 （ ） 1 引言 . 1 1.1 超氧化物歧化酶的概况 . 1 1.2 超氧化物歧化酶的分类及其分布 . 1 1.3 SOD 的作用机理 . 2 1.4 SOD 产品研究现状和应用前景 . 2 1.5 SOD 分离提纯的几种主要方法 . 3 1.6 本实验所采用的 SOD 提纯方法概述 . 3 2.1 材料与试剂 . 4 2.
5、1.1 材料 . 4 2.1.2 试剂 . 4 2.2 实验仪器 . 4 2.3 实验方法 . 4 2.3.1 微生物 细胞中提取 SOD . 4 2.3.1 粗酶液的制备 . 4 2.3.1.2 粗酶液的热变性处理 . 5 2.3.1.3 PEG-20000 浓缩 SOD . 5 2.3.1.4 SepHadex G-100 分子筛纯化 SOD . 5 2.3.1.5 SOD 活性的测定 . 7 2.3.1.6 SOD 酶液浓度的测定 . 8 2.3.1.7 聚丙烯凝胶电泳（ SDS-PAGE） . 8 2.3.1.8 微生物 SOD 分离纯化的工艺流程图 . 10 2.3.1.9 SOD
6、最适温度和热稳定性实验 . 10 2.3.2 猪血中提取 SOD . 12 2.3.2.1 分离红血球 : . 12 2.3.2.2 洗 涤红血球 . 12 2.3.2.3 溶解破碎血细胞 . 12 2.3.2.4 萃取 . 12 2.3.2.5 第一次丙酮沉淀 . 12 2.3.2.6 热处理 . 12 2.3.2.7 二次丙酮沉淀 . 13 2.3.2.8 猪血 SOD 分离纯化的工艺流程图 . 13 2.3.2.9 猪血中 SOD 活性的测定 . 14 2.3.2.10 猪血中 SOD 酶液浓度的测定 . 14 2.3.2.11 猪血中 SOD 热稳定性实验 . 14 2.3.2.12
7、pH 值对酶活性的影响实验 . 14 3.1 基因工程菌 SOD 的各种性质 . 15 3.1.1 PEG-20000 浓缩 SOD . 15 3.1.2 SepHadex G-100 分子筛纯化 SOD . 15 3.1.3 考马斯亮蓝法测定 SOD 酶液蛋白浓度结果 . 15 3.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）结果 . 16 3.1.5 基因工程菌 SOD 热稳定性试验 . 17 3.1.6 pH 值对酶活性的影响试验 . 18 3.2 猪血中 SOD 的各种性质 . 18 3.2.1 样品蛋白质含量测定结果 . 18 3.2.2 猪血 SOD 热稳定性试验 . 19 3
8、.2.3 pH 值对酶活性的 影响试验 . 19 3.3 基因工程菌 SOD 及猪血 SOD 性质比较 . 20 3.3.1 在酶活方面用邻苯三酚法测定留样的酶活 . 20 3.3.2 在最 适温度方面 . 20 3.3.3 在热稳定性方面 . 21 3.3.4 在最适 pH 方面 . 21 致 谢 . 错误 !未定义书签。 参考文献 . 24 1 1 引言 1.1 超氧化物歧化酶的概况 氧的某些代谢产物及其衍生的含氧物质都是直接或间接由氧转化而成的 1。由于它们都含有氧，而且具有较活泼的化学反应特性，遂统称为活性氧（ Active oxygen species， AOS）， AOS 包括超氧
9、根离子（ O2-）、氢氧根离子（ OH-）、羟自由基（ O 2）、过氧化氢（ H2O2）、单线态氧（ 1O2）和过氧化物自由基（ ROO-）。它们可导致膜脂过氧化、碱基突变、 DNA 链断裂和蛋白质的损伤等。植物体再正常生长条件下也能产生少量的 O2-，它主要来源于线粒体的电子转移系统、光合作用，以及一些氧化还原酶的产物。但再正常生理情况下，活性氧在不断产生，也不断被 清除 ，因而不会造成自由基对机体的损伤 2。 SOD 是一种具有特定生物催化功能的蛋白质，由蛋白质和金属离子组成 ，它广泛存在于自然界的动物、植物以及一些微生物的体内。 1938 年 Mann 和 Keilin 首次从牛血红细胞
10、中得到了一种含铜蛋白， 1969 年 Mc Cord 和 Fridovich 发现此蛋白能够使超氧阴离子自由基 O2-发生歧化反应，因而将其定名为超氧化物歧化酶。 1.2 超氧化物歧化酶的分类及其分布 按金属辅基成分的不同可分成 3 种类型 3。最常见的一种含有铜锌金属辅基 (CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-SOD 酶蛋白的分子量约为 3.2104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由 2 个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基 (肽链 )含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心 是铜。第二种含有锰离子
11、(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由 4 条或 2 条肽链组成。第三种是 Fe-SOD，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。 Fe-SOD 纯品呈黄色或黄褐色，由 2 条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个 Fe 原子。 90 年代，人们又陆续从链霉菌属中发现了 Ni-SOD 和 FeZn-SOD，在牛肝中发现了一种CoZn-SOD 等不同的 SOD，这些都是少见的 SOD4。 2 1.3 SOD 的作用机理 生存环境的变化是不可避免的 , 任何生物必须去适应各种变
12、化。以植物为例 ， 经研究发现 ，不同条件、不同物种、不同的发育时期及不同器官发生胁迫后 ， SOD 活性表现有升有降。然而 SOD活性不论是升高还是降低 ， 都表现出抗性强的品种比抗性弱的品种活性高。即当 SOD 活性降低时 ，抗性强的品种下降幅度小 ； 当 SOD 活性升高时 ， 抗性强的品种升高幅度大 ； 或者抗逆性强的品种活性升高而抗逆性弱的品种降低。这说明在逆境条件下植物的抗性强弱与植物体内能否维持较高的 SOD 活性水平有关 5 6。 SOD 的作用底物是 生物体内产生的超氧阴离子自由基 O2-， 作用机理是 ： SOD+ O2- SOD-+O2 SOD-+O2 SOD+H2O2
13、总反应： 2O2-+2H+ O2 + H2O2 之后 H2O2 被抗坏血酸和过氧化氢酶（前者是主要的）分解为 H2O2 和 O2，从而解除 O2-所造成的氧化胁迫 7。 1.4 SOD 产品研究现状和应用前景 SOD 在食品当中得到了广泛的应用。现已开发出来很多富含 SOD 的食品，如 SOD 草莓、 SOD啤酒、 SOD 苹果、 SOD 桃子、 SOD 绿豆芽、 SOD 活性茶以及 SOD 橙等，营养丰富，市场经济效益很好，有很好的发展潜力。 另外 SOD 无论是剂型、用药途径还是临床应用范围都是相当广泛的，是一种具有广阔前景的蛋白多肽类药物，其药用领域潜力很大。 目前国内外利用 SOD 治
14、疗的病种有：氧中毒；恶性肿瘤；辐射损伤防护；抗炎作用等。虽然SOD 是毒副作用很小的生物大分子，但作为抗原，多次注射体内仍可诱发免疫反应和过敏反应，而且其来源十分有限，故将 SOD 用作药物的最理想的方法是进行 SOD 的基因克 隆和表达。近年(氧化型 ) （还原型） (氧化型 ) （还原型） SOD 酶 3 来，美、日、英、等国已相继开发了 SOD 基因工程产品，并进行了临床实验，日本三井东亚化学公司最早生产重组人 Mn-SOD 并将其用于治疗心肌梗塞后缺血再灌注的心肌保护剂。 由于人的皮肤直接与氧气接触，会造成皮肤的老化和损伤。 SOD 在保护皮肤、防止氧化等方面的效果比较突出，为此也开发
15、了一些富含 SOD 的保健品，通过食用来抵抗衰老。 此外，国内不少化妆品中都添加了 SOD,如国内的大宝 SOD、康妮 SOD、 SOD 康舒达霜等产品，对保养皮肤、防止衰老、阻止老年斑的生产有一定的效果 8。 1.5 SOD 分离提 纯的几种主要方法 不管以何种途径得到的 SOD，其分离纯化方法主要有沉淀法、热变性法、色谱分离法、凝胶过滤和离子层析柱法以及超滤法。其中沉淀法和热变性法具有成本低、工艺简便、等特点，比较适合工业化大规模生产 SOD。但是也有他们不足的地方，例如沉淀法要用到丙酮这种有机物，无疑增加了对环境的污染和操作人员身体上的伤害。热变性法则只能得到 SOD 的粗酶液，无法对其
16、进行进一步的分离纯化。如果对产品的要求不高尚可以用此方法，如果要求得到高纯度的 SOD 则此方法显然不能满足生产需要。相比较传统的沉淀法、热变性法，用色谱分离法 、凝胶过滤和离子层析柱法以及超滤法得到的 SOD 则纯度更高，但是由于其成本较高，工艺过程复杂，提纯周期较长，因此比较适合实验室小规模生产。 1.6 本实验所采用的 SOD 提纯方法概述 本实验利用重组 SOD 的热稳定性，用热变性法代替传统的硫酸铵分级沉淀蛋白质，探索出一条比较简便易行的 SOD 分离提纯方法。即先用超声波法将大肠杆菌菌液破碎，再用热变性法去除杂蛋白，得到 SOD 粗酶液，最后经过 PEG20000 浓缩和 SepH
17、adex G-100 分子筛柱层析法去除小分子蛋白得到高纯度的 SOD 酶液， 同时对猪血中的 SOD 采用两 次丙酮沉淀法和热处理工艺提纯。用考马斯亮蓝法测定其蛋白浓度，用邻苯三酚法测其活性，最后得出所提取的 SOD 的比活 ,并且测其热稳定性 9。 4 2 材料与方法 2.1 材料与试剂 2.1.1 材料 本课题组前期已经构建表达质粒 pET -SOD并转化大肠杆菌 BL21（ DE3）获得重组菌 。 1000ml猪血购自菜市场。 2.1.2 试剂 Buffer A（为 20mmol/L This-Hcl 溶液）、 PEG20000（ Sigma 公司）、 SepHadex G-100(发
18、玛西亚）、邻苯三酚溶液（ 4.5mmol/L）、考马斯亮蓝溶液（ 含 0.01%(W/V)考马斯亮蓝 G250 ， 4.7%(W/V)乙醇 ）、标准蛋白溶液（自配， 1mg/mL 的牛血清蛋白）、 柠檬酸三钠，氯化钠， 95%乙醇，氯仿，丙酮， KH2 PO4， K2HPO4， 其余的为国产分析纯试剂。 2.2 实验仪器 本次实验用到的主要仪器有：紫外可见光分光光度计（北京普析通用 TU1810）、恒温水浴锅（上海一恒 CU420）、自动部分收集器（ BIORAD Biologic LD）、磁力搅拌器（ XK78-1 姜堰市新康医疗器械有限公司）、梯度 混合器（ BIORAD Biologic
19、 LD）、冷冻高速离心机（湘仪 21K）、电子天平（赛多丽斯 BS223S）、稳压稳流电泳仪（大连捷迈）、 pH 计（赛多丽斯 PB-10）、超声破碎仪（无锡上佳 GA92-II D）、各种规格的移液枪（ BIOHIT）、组织剪切机（上海标本模型厂 DS-I）、冷冻层析柜（北京博医康 YC-I） 2.3 实验方法 2.3.1 微生物细胞中提取 SOD 2.3.1 粗酶液的制备 将发酵液离心后收集菌体，称取 10g 菌体，按 1： 20 的比例溶解在 200mL 的 Buffer A 中，用组织剪切 机间歇匀浆 30min 左右，得到大肠杆菌菌悬液，取 50mL 菌悬液，冰浴中用超声波细胞5 破
20、碎机破碎细胞，超声功率设定为 200W，每次工作 3S，停 3S，持续 30min。超声液在 4 下 7000rpm离心 30min，获得的上清液即为粗酶液 11。 2.3.1.2 粗酶液的热变性处理 将 SOD 粗酶液置于 90 的恒温水浴锅加热 1h， 4 下 7000rpm 离心 30min，弃沉淀，取上清共 45mL。 2.3.1.3 PEG-20000 浓缩 SOD 在透析袋中加入上一个步骤得到的 45mL 上清，将透析袋平放在瓷盘 上，瓷盘中撒入PEG-20000，透析 6h，收集得到的蛋白浓缩液，得浓缩的蛋白液 10mL。 2.3.1.4 SepHadex G-100 分子筛纯化
21、 SOD18 2.3.1.4.1 SepHadex G-100 凝胶的预处理 (1) 100mL 烧杯，称取 5g sepHadex G-100，加入 50mL 去离子水，浸泡溶胀 24h。 (2) 倾去 sepHadex G-100 溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的 1.0 mol/L NaOH 液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡 1h 处理后倾去。用去离子水洗涤。洗涤过程 中，用倾去法除去细颗粒。其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分用力搅拌，以防止颗粒破碎），放置数分钟，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉。浮选 5 次，直至上层没有细颗粒为止，再浸泡水洗至 pH 中性。 (3) 将 SepHa
22、dex G-100 凝胶水溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气 30min，除去凝胶溶液内的气泡，将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入烧杯中，其中盛有 1/2 去离子水。 2.3.1.4.2 装柱 （ 1） 层析柱 (50cm)用水清洗干净，柱的上、下端联接塑料管接上小乳胶管，装上螺旋夹。将层析柱垂直装好。校直过 程用下端绑有钥匙的绳子挂于铁架的不同位置，从多角度校正使柱垂直。打开柱上端口，从柱底下出口管朝柱内注入水，使柱底全部充满水而不留气泡，关闭柱出口。最终柱内留存有 2 cm 的水。从出口处接上一根直径 2 mm 细塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。 （ 2）搅动凝胶溶液（切勿搅动太快，以免空气再逸入），使形成均一的薄胶浆，并立即沿玻棒
