1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 熊果苷中间体单乙酰对苯二酚的制备 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 由于熊果苷对黑色素合成酶酪氨酸酶有很好抑制效果，对人体肌肤有良好的美白作用，因而在化妆品中得到广泛作用 。由于天然提取法工艺复杂、生产成本高、不能大规模生产，人工合成法是熊果苷的主要制备方法。本文综述了熊果苷的合成与检测方法的研究进展，通过有机合成法 ，酶合成法和生物转化法等 3 种合成熊果苷方法的比较，阐述有机合成法是制备熊果苷的主要方法 。 本论文拟在重复文献报道的单乙酰对苯二酚制备方法的基础上设计一条新的合成路线，避
2、免文献方法中选择性差的缺点。 关键词 : 熊果苷，单乙酰对苯二酚，合成 II Abstract: Arbutin is widely used a cosmetic additives since its inhibiting effect on human tyrosinase and skin whitening properties. However , artificial synthesis becomes the dominantmeans of arbutin because of the complicated procedures and the high cost of e
3、xtracting from natural plant . The developments of both arbutin synthesis and determination method were in troduced here. It was found that organic synthesis was the main method for preparation of arbutin by comparing the three ap -proaches of arbutin preparations organic synthesis, enzymatic synthe
4、sis and biotransformation synthesis. To avoid the literature method selectivity shortcomings, this thesis intends to design a new synthetic route based on the reported method for preparation of single-acetyl hydroquinone. Keywords: arbutin; Single-acetyl hydroquinone; synthesis 1 目 录 摘要 Abstract 1 绪
5、论 . 1 1.1 选题的背景和意义 . 1 1.2 相关研究的最新成果及动态 . 1 1.2.1 天然产物提取法 . 1 1.2.2 植物组织培养法 . 2 1.2.3 酶转化法 . 3 1.2.4 化学合成法 . 4 2 实验部分 . 5 2.1 合成路线 . 5 2.1.1 直接制备法 . 5 2.1.2 间接制备法 . 5 2.2 单乙酰对苯二酚的制备过程 . 5 2.2.1 单苄基对苯二酚 . 6 2.2.2 单苄基乙酰对苯二酚 . 6 2.2.3 单乙酰对苯二酚 . 6 3 结果与分析 . 7 3.1 实验结果 . 7 3.2 实验分析 . 7 4 结论 . 8 参考文献 . 9
6、致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 选题的背景和意义 熊果苷作为一种天然存在的化学物质，首次发现于熊果属的植株叶子中。该属植物主要分布于西欧、北美一带，国内未有其分布的报道。以后的研究发现，在杜鹃花科、蔷薇科以及虎耳草科等不同属种的植株中也发现有熊果苷的存在。 熊果苷化学名称为对羟基苯基 -D-吡喃葡萄糖苷，分子结构如图 l 所示。 其药理活性报道有利尿、抗菌并与可待因 (codeine)具有等效的镇咳效果 1,2。自 20 世纪 90 年代以来，研究者发现熊果苷作为酪氨酸酶的抑制剂，能阻断多巴以及多巴醌的合成，从而有 效地抑制黑色素的生成，具有美白作用，且对皮肤没有刺激性
7、，毒副作用小 3。熊果苷作为美白剂广泛应用于化妆品中，国内外市场需求十分巨大，是美白祛斑类化妆品的首选主要原料。 熊果苷与其他传统性美白剂 (如汞盐。壬二酸、对丞二酸、对丞二酸草丞醚 )相比较祛斑效果高，安全无毒，使用方便等优点，它呈集 “绿色植物 ”安全可靠。配伍性好，高效脱色 二者合一于体的皮肤美白剂。是本世纪末新兴起来的新型的距世纪产品颇有时代的特色。 1.2 相关研究的最新成果及动态 熊果苷在护肤用品和发用制品方面有广泛的用途 4。 近几年 来 , 国内熊果苷的生产和相关化妆品的开发有了迅速的发展 , 国外对熊果苷的研究和开发更为深入 , 并取得了许多进展。这些进展包括 : 作用机理的
8、研究 ; 化妆品处方中与熊果苷配伍的其他活性物质 ; 治疗作用 ; 衍生物 ; 熊果苷的来源和制备方法。这里主要介绍制备方法的进展。 1.2.1 天然产物提取法 主要利用铅盐法 5。其一般步骤是：含熊果苷的植物叶子采集加工 用乙醇或水作萃取 将萃取液过滤，并将过滤物洗涤，合并滤液 将滤液用饱和的中性乙酸铅水溶液处理，沉淀其中的2 有机酸、酚酸、鞣酸、黄酮类等成分，生成不溶 性铅盐沉淀 滤出沉淀，滤液用碱性铅水溶液使熊果苷生成非水溶性铅盐沉淀 滤出沉淀，悬浮于蒸馏水中，向悬浮液通入硫化氢气体，生成胶态的硫化铅沉淀，调节 pH，防止熊果苷水解 将硫化铅胶状沉淀用抽滤法抽出，滤物水洗，合并滤液 将滤
9、液减压浓缩，即可离析出满足化妆品之需的熊果苷晶体。 1996 年， Matsuda 等从六种熊果叶中得 50%乙醇提取物 6，进一步分离后得到熊果苷粗品，占熊果叶干重的 5%左右。 也可采用柱层析法。利用大孔吸附树脂分离等现代分离手段，从萃取液中得到熊果苷。但是这方面的研究未见报道。 熊果苷在熊果叶中的含量低，分离步骤繁多，提取物中熊果苷的纯度不高，故经济应用价值不大。但是由于现代人追求纯天然绿色化妆品的理念，仍然有厂家从植物叶子中提取天然熊果苷，作为高档美白化妆品中的添加剂。 由于含熊果苷的天然植物来源困难，近年来兴起利用植物细胞培养来生产熊果苷的研究。 1.2.2 植物组织培养法 该方法主
10、要是利用植物细胞强大的糖基化能力，将外源氢醌转化为熊果苷。 1992 年，横山峰幸 7报道说，在长春花 (Catharanthus roseus)植物细胞培养悬浮液中加入氢醌，可制得熊果苷。 该研究表明，细胞培养时间及添加氢醌的时机对产率的影响极大，该文献所报道的熊果苷最高产率为 9.2g/L。 林口能孝 8等利用长春花细胞培养法合成熊果苷。该方法将长春花细胞在培养基中于暗处摇床培养 8 天，过滤，将收集的细胞在新鲜培养基中再培养四天，新培养基中加入浓度为 22g/L 的氢醌水溶液，可得到 147mg 熊果苷 g(细胞干重 )。 在国内， 2001 年赵明强 9等研究者报道了应用人参毛状根细胞
11、培养合成熊果苷的方法。该研究表明，培养 22 天的人参毛状根细胞更换含氢醌底物的培养基后，氢醌浓度为 2mmol/L， 持续转化 24 小时后，所合成的熊果苷占细胞干重的 13%，转化率可达 89%。该方法采用人参毛状根细胞合成熊果苷的优点是，终产物只需进行简单的处理即可添加于化妆品中，因为人参细胞本身也含有多种活性物质，如人参皂甙等，适应化妆品的要求。以人参细胞培养合成熊果苷为特色的丁家宣美白化妆品在市场上取得很大的成功。 利用植物组织培养法生产天然药物，是近来生物技术研究热点之一。它的优点是不受环境生态和气候条件的限制，增殖速度比整个植株栽培快很多。目前，利用植物细胞培养生产熊果苷，转化率
12、较高，主要存在的问题是生产周期过长，有用 物质含量较少，造成后续分离困难。对植物细胞生长的机理了解不够深入，往往是凭经验控制氢醌的添加时机。利用植物细胞培养合成熊果3 苷是今后研究热点之一。 1.2.3 酶转化法 该法主要以糖基转移酶或糖苷酶作为催化剂，通过转糖基反应或逆水解反应合成熊果苷。 1.2.3.1 转糖基反应 Glycosyl-OR1+ R20H Glycosyl -OR2 十 H-OR 对于上述反应而言，酶底物为双糖或者多糖，发生糖基转移反应，离去基团为糖基，反应为动力学控制。水作为竞争性亲核物质，可发生水解副反应。 糖基转移酶能特异性地 催化糖基从糖基供体如 UDP 衍生物转移到
13、目标产物，该酶催化效率很高，但由于反应所需的糖基供体十分昂贵，因此它们在体外的应用很少。 1995 年， Ping Wang 等人报道 10说，利用从牛肝中提取的葡萄糖苷酶，催化氢醌与对硝基苯葡萄糖苷之间的转糖苷反应，生成熊果苷。该反应能在 8 小时后使 65%的氢醌转化为熊果苷。转糖苷反应的效率很高，限制其大规模应用的原因是活性糖苷中间体对硝基苯葡萄糖苷过于昂贵。 1.2.3.2 逆水解反应 Glycosyl-OH+ R1OHGlysoyl -OR1+ H2O 对于上述 反应而言，当酶底物为单糖时，发生可逆水解反应。该反应是热力学控制。 -葡萄糖苷酶能催化合成单一异构体的糖苷。通过控制反应条
14、件，可在非水相中催化糖苷水解酶逆水解反应合成糖苷，该方法是舍成且一葡萄糖苷特别有吸引力的方法。 1993 年，下出绫子等人报道 11说， 30%(质量体积 )的葡萄糖溶液和 10%(质量体积 )的氢醌溶液，用 -葡萄糖苷酶催化，在 pH5 以及 40 环境下保持 72 小时，得 0. 11%的熊果苷。 1994 年，荒川博邦 12等人利用商品纤维素酶 Tamano 将氢醌与纤维素转化为熊果苷。据其报道， 7%（质量体积）的氢醌和 5%（质量体积）的滤纸粉，在该酶作用下， 40 培养 96 小时，得到 8mg 熊果苷与 5mg 氢醌 -O-D 纤维二糖。 总体来说，有关非水相中糖苷酶逆水解反应合
15、成熊果苷的相关文献不是很多，所得熊果苷的产率也较低。这可能是由于氢醌的对羟苯基的空间位阻效应比较大，同时由于反应物在有机溶剂中的溶解度比较小，阻碍了熊果苷的生成。 通过非水相中逆水解法酶法合成熊果苷只需要一步反应，且能保持反应物的立体构型，不需4 要进一步拆分，因此可以大大节省后续提取成本。该方法发展潜力巨大。找到合适的酶源以及提高 逆水解合成的收率是今后研究的重点。 1.2.4 化学合成法 该法主要以葡萄糖与氢醌为原料，通过化学法合成熊果苷。化学合成法采用经典的Koenigs-Knorr 反应，即将葡萄糖乙酰化再经过溴取代后得到溴代四乙酰葡萄糖，然后再与单侧链保护氢醌在碱性催化剂作用下缩合得
16、到五乙酰葡萄糖，脱乙酰基得到熊果苷。反应过程如下图所示： 最早关于熊果苷化学合成的报道 13是应用溴化银，喹琳为催化剂，溴代四乙酰葡萄糖与氢醌单苄酯缩合，再经脱乙酰基和苯甲酰基制得熊果苷。该方法由于试剂较贵，反应步骤较多，已不常用。 邵 颍 14等人报道了以三氯氧磷为催化剂，五乙酰葡萄糖与氢醌单苄基醚缩合，再经脱乙醚基团，苄基制得熊果苷。该方法由于其关键反应试剂对苯甲氧基苯酚需自己合成，且产率不高，限制了该法的进一步发展。 李雯等人报道用相转移催化剂合成熊果苷 15。该方法利用溴代四乙酰葡萄糖与单乙酰氢醌，经相转移催化得到五乙酰熊果苷，再经甲醇钠一甲醇体系脱保护基后得到熊果苷。该方法的关键步骤
17、是单乙酰氢醒的合成，控制反应体系中氢醌与乙酸酐的物料比，是反应成功的关键。另有应用有机锡化合物脱乙酰保护基的报道。 化学法合成熊果苷都需要加保护基 团和脱保护基团的步骤。但是利用化学法合成相对而言收率较高，成本较低，是市场上大部分熊果苷的来源。 5 2 实验部分 2.1 合成路线 2.1.1 直接制备法 对苯二酚与乙酸酐直接反应，选择性地与其中一个羟基发生乙酰化制得单乙酰对苯二酚。 H O O H + A c 2 O H O O A c 图 2-1 直接制备法合成单乙酰对苯二酚 在反应瓶中加入 2mol/L NaOH 水溶液 20mL，对苯二酚 3.3g（ 0.03mol），冰浴，剧烈搅拌，缓
18、慢滴加乙酸酐 2g（ 0.02mol），反应 1h，用氯仿提取，水洗至中性，干燥，减压蒸干，用无水乙醇分步结晶，除去双乙酰对苯二酚，蒸发得固体 0.83g，收率 18.1%， m.p. 6162 。 此方法合成路线短，但选择性差，产物中大部分为双乙酰化产物，且两种化合物较难分离。 2.1.2 间接制备法 针对以上方法中的不足本论文设计了新的单乙酰对苯二酚制备方法 间接制备法。该方法使用苄基保护基对两个酚羟基中的一个进行保护，由于苄基体积较大，所以单苄基化选择性高，基本不产生双苄基化产物，然后再对另外一个位发生苄基化反应的酚羟基进行 乙 酰化反应，最后脱去苄基保 护基，得到目标产物单乙酰对苯二酚
19、。该方法虽然路线长，但选择性好，产品纯度高，避免了多次分步重结晶的提纯操作，与直接制备法相比有一定地优越性。 H O O H + C H 2 C l H O OH 2CA c 2 OA c O OH 2C A c O O H脱 苄 氢 解图 2-2 间接法制备单乙酰对苯二酚 2.2 单乙酰对苯二酚的制备过程 6 2.2.1 单苄基对苯二酚 取 100ml 三口瓶一只，配备温度计、回流冷凝管、滴液漏斗。向其中依次加入 1， 4-苯二酚3.3g（ 0.03mol），乙醇 11ml，氯苄 3.45ml（ 0.03mol），加热至 85 使固体溶解。取 1.4gNaOH 放入 50ml 小烧杯中，加入
20、 3.3ml 乙醇及 3.3ml 水，搅拌使溶解。将溶解好的溶液倒入滴液漏斗滴入三口瓶中（ 1 滴 /秒）。滴完后， 88 回流反应 1.5h。停止反应，冷却降温。将放冷的反应液倒入100ml 冰水中，调节 pH 34（稀 HCl）。抽滤，取滤液放入 250ml 烧杯中。向烧杯中加入 1mol/L NaOH 50ml，搅拌 10min。抽滤，取滤液。用稀 HCl 将滤液 pH 调至 2。抽滤、水洗、取滤饼、干燥。乙醇重结晶 ，干燥得到类白色小叶状晶体 3.789g，收率 63.2%， m.p. 119.9120.4 。 2.2.2 单苄基乙酰对苯二酚 在 50ml带有回流冷凝管，温度计及玻璃塞
21、的三口瓶中，加入单氢醌苄醚 2.0g（ 0.01mol）， 1mol/L NaOH 15ml，搅拌溶解。将反应液冷却至 05 。用滴液漏斗滴加 Ac2O 至上述反应液中（注意，滴加速度控制 t=05 ），滴毕 05 反应 1h，得白色悬浊液，抽滤，干燥后得白色粉末状固体 1.95g，产率： 71.7%。 2.2.3 单乙酰对苯二酚 将 4-苄氧基苯酚乙酯 2.72g（ 0.01mol）溶于无水甲醇 (20ml)，加入 5 Pd-C(0.8g)，于 60 /3.5MPa 下氢化 4h，滤除催化剂，减压蒸干，残余物溶于乙腈 (5ml)，回流搅拌下滴加乙酸乙酯至稍显浑浊，降至室温，冰箱放置过夜，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗，干燥得白色固体 单乙酰对苯二酚 1.33g，产率 87.5%。
