1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 淀粉酶菌株鉴定及酶的制备 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 从 自然界 中分离得到一株 高 产 淀粉酶 菌株，根据菌落形态和常规生理生化鉴定方法对菌株进行鉴定，为了确定该菌株在分 类学上的位置，对这一菌株进行 16S RNA分子鉴定。主要是通过 16S rDNA测序与 GenBank中已有的序列比对来鉴定菌种 ， 序列比对 鉴定为与 Bacillus amyloliquefaciens有 99%的相似度 。 通过分级盐析进行酶制备，纯化倍数为 4.99，活力回收率为 33%。实验对菌株进行
2、了酶学性质的研究， 该酶的最适反应温度为 60 ，最适反应 pH值为 6.0。 关键词 : 淀粉酶 ； 菌种鉴定 ； 酶制备 II Abstract: A strain of amylase producing was isolated from nature. The strain was identified by the shape and general physiological and biochemical properties. In order to confirm the location in taxonomy, 16S rDNA sequence of the stra
3、in was sequenced and it had the similarity of 99 with that of the Bacillus amyloliquefaciens. Amylase which is extracellular in incubation period of the strain can be purified by salt out. The optimum temperature of amylase is 60and the optimum pH is 6.0. Keywords: amylase; strain identification; pr
4、eparations of enzymes目 录 摘要 Abstract 1 绪论 . 1 1.1 高产淀粉酶的来源 . 1 1.2 菌种鉴定的方法概况 . 1 1.3 -淀粉酶的研究 . 2 1.3.1 -淀粉酶分离纯化方法的研究 . 2 1.3.2 -淀粉酶活力测定方法的研究 . 3 1.4 淀粉酶的应用 . 3 1.4.1 在食品工业中的应用 . 3 1.4.2 在 造纸 业中的应用 . 3 1.4.3 在 清洁剂生产 中的应用 . 3 1.4.4 在 医药行业 中的应用 . 3 2 实验方法 . 4 2.1 材料 、试剂和仪器 . 4 2.1.1 生物材料 . 4 2.1.2 主要试剂
5、 . 4 2.1.3 培养基配方 . 4 2.1.4 主要仪器和设备 . 4 2.2 实验方法 . 5 2.2.1 菌种活化和培养 . 5 2.2.2 菌落及生理生化特性鉴定 . 5 2.2.3 菌种的分子鉴定 . 5 2.2.4 菌种的发酵 . 6 2.2.5 淀粉酶活力测定 . 6 2.2.6 蛋白质含量 的测定 . 6 2.2.7 酶的制备 . 6 2.2.8 酶学性质研究 . 7 3 结果与分析 . 9 3.1 菌落生理生化特性鉴定 . 9 3.2 菌株分子鉴定结果 . 9 3.3 淀粉酶分离纯化结果 . 10 3.4 淀粉酶酶学性质的研究结果 . 11 3.4.1 酶反应的最适温度和
6、酶的热稳定性研究 . 11 3.4.2 酶反应的最适 pH 值和酸稳定性 . 12 4 结论 . 14 参考文献 . 15 致 谢 . 17 1 1 绪论 淀粉酶是一种能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称，它是最早用于工业化生产并 且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等 -1,4-葡聚糖，是水解 -1,4-糖苷键的酶。不同种类的淀粉酶水解淀粉会生成不同的糖类产物，根据淀粉水解生成糖类产物的异头碳原子构型的不同可将淀粉酶分为 -淀粉酶和 -淀粉酶。 -淀粉酶作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开 -1,4 糖苷键，生成糊精
7、和还原糖， -淀粉酶分布广泛，已是一种十分重要的酶制剂， -淀粉酶大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、和医药行业等，它占了整个酶制剂市场份额的 25%左右 1。 1.1 高产淀粉酶的来源 除动物自身消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物， 但是在我国，淀粉酶制剂的品种和生产菌株都很单一，淀粉酶酶活也较国外同行业低。在近年来的菌种选育中，尽管转导转化和基因克隆等现代分子生物学技术已经广泛应用，但是目前投入商业化生产的淀粉酶生产菌株几乎都是通过从自然界中分离得到的野生型菌株，然后加以改良得到。 1.2 菌种鉴定的方法概况 2 通常可把微生物的分类鉴定方法分成 4 个不同
8、水平：细胞的形态和习性水平，例如用经典的研究方法，观察微生物的形态特征、运动 型、酶反应、营养要求、生长条件、代谢特性、致病性、抗原性和生态学特性等；细胞组分水平包括细胞壁、脂类、醌类和光合色素等成分的分析；蛋白质水平，包括氨基酸序列分析、凝胶电泳和各种免疫标记技术等；核酸水平，包括 G+C mol%值的测定，核酸分子杂交， 16S 或 18SrRNA 寡核苷酸序列分析，重要基因序列分析和全基因组测序等。 形态学分类方法属传统历史分类法但它存在很多弊端。因为外观特征是细胞内部基因与外界环境因素综合作用的结果，环境因素的差异常导致外部表型的变化，如仅依靠外观也正进行分类研究，易受到各种环境 因子
9、的干扰。因而依靠外部形态而建立的分类系统就有可能存在或多或少的偏差，会导致分类结果与系统进化的不一致性，因此以形态学标准作为菌种鉴定特征是有条件的，而且主观上所观察到的特征往往会引起疑议。分子生物学分类手段是从雾中细胞内物质（如DNA）的考察入手，揭示微生物间的本质联系与区别。因为细胞内物质不易受到外界因素的干扰，十分稳定。因此传统形态分类须以现代生物学技术所揭示的物种间的本质联系与区别为客观依据，对现有的分类体系进行补充、完善和提高。而分子生物学分类手段也要以传统形态分类所建立分2 类系统为参考，这样建立 的新的分类系统才能更接近微生物间的真实遗传关系。 1.3 -淀粉酶的研究 1.3.1
10、-淀粉酶分离纯化方法的研究 高纯度 -淀粉酶是一种重要的水解淀粉类酶制剂 ， 可用于研究酶反应机理和测定生化反应平衡常数等。分离纯化 -淀粉酶的方法很多 ， 一般都是依据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质建立的。要得到高纯度的 -淀粉酶 ， 往往需要将各种方法联合使用。盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析和电泳等 ， 是蛋白质分离纯化的主要方法。用吸附树脂法、 40%乙醇从 -淀粉酶发酵液中分离高活性 -淀粉酶，用离子交换法和透析法对初酶液进行脱盐处理，最后用 DEAE纤维素纯化 淀粉酶，所得酶活力为 60153U/g，酶活性回收率为 6
11、6.04%3。另通过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析等方式 ， 从白曲霉菌 A. kawachii 的米曲粗抽出液中 ， 分离纯化到两个耐酸性 -淀粉酶比活性极高的组分。用疏水吸附法和 DEAE-cellulose(二乙氨基乙基 -纤维素 )柱层析法分离纯化 -淀粉酶 ， 所得酶活力为 110 000 U/g。用硫酸铵沉淀和垂直板制备凝胶电泳对地衣芽孢杆菌 A. 4041 耐高温 -淀粉酶进行分离纯化 ， 得到 3 种电泳均一的组分。通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳 ， 对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸性 -淀粉酶进行纯化 ， 得到电泳纯级的超耐热耐酸性 -淀粉酶 ， 纯
12、化倍数为 11. 7， 活力回收率为 29. 8%4。但上述方法存在的共同问题是 ， 连续操作和规模放大都比较困难。双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。应用双水相系统 PEG/磷酸盐分离纯化 -淀粉酶 ， 增加 PEG 浓度有助于酶富集上相。同样用PEG/磷酸盐双水相体系从发酵液中直接萃取 分离低温 -淀粉酶 ， 分配系数及回收率分别为 4. 8 和87%5。 PVP(聚乙烯吡咯烷酮 )和硫酸铵对酶活力具有保护作用 ， 利用 PVP/硫酸铵液 -固萃取体系分离提取耐高温 -淀粉酶 ， 酶活力回收率高 ， 体系成相时间短 ， 操作时不需双水相体系所用的分液漏斗和离心操
13、作 ， 用倾液法即可实现相分离 ， 因此 ， 与双水相体系相比 ， 液 -固萃取体系具有更大的优越性 6。 1.3.2 -淀粉酶活力测定方法的研究 测定 -淀粉酶活力的方法已不少于 200 种 ， 其共同之处是 ， 被测样品与某种多糖底物溶液保温反应后测之 ， 很难标准化。碘 -淀粉比色法 测定 -淀粉酶活力的优点是 ， 操作简便 ， 试剂便宜 ，比色精确、敏感。因此 ， 成为受推荐的淀粉酶活力测定方法。盛勤芳 7提出要提高糖化型淀粉酶活力测定的准确性须注意酶反应时间的选择和酶的控制。严控制测定时间十分重要，为了保证10min 内（初速度时间范围内） 50 ，底物（淀粉液）必须预保温 5-10
14、min。为了能得到准确的测3 定结果，在实验设计中，对空白与样品滴定值之差（ B-A）一般控制在 1.0-2.6ml；若（ B-A）小于1.0ml，表明酶浓度过小；若（ B-A）大于 2.6ml，表明酶浓度偏高。（ B-A）这个值可以通过 调整酶的稀释倍数，使之控制在 1.0-2.6ml 范围内。 1.4 淀粉酶的应用 1.4.1 在食品工业中的应用 各种酶制剂在食品工业中的应用已有上百年的历史 ， 最近几十年 -淀粉酶广泛地应用于焙烤工业中 -淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大 ， 纹理疏松；提高面团的发酵速度 ;改善面包心的组织结构 ， 增加内部组织的柔软度；产生良好而稳定的面包外表色
15、泽 ； 提高入炉的急胀性；抗老化 ， 改善面包心的弹性和口感；延长面包心储存过程中的保鲜期。 目前 ， 焙烤工业使用的 -淀粉酶主要来自大麦麦芽、真菌和细菌。 1955 年 ， 美国 批准真菌 -淀粉酶作为面包添加剂。 1963 年 ， 英国证实了它们的安全性 8。现在 ， -淀粉酶已经在全世界范围内使用。 1.4.2 在 造纸 业中的应用 淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层淀粉，由于造纸施胶过程中要保持淀粉乳的粘度 ， 压扎机也要根据所造纸的级别来调整施胶的粘度 ， 而且天然淀粉的粘度较高需经处理降低其粘度后才能用于表明施胶 ， 因此需要用 -淀粉酶间歇式或连续降解淀粉来调整淀粉乳的
16、粘度。 1.4.3 在 清洁剂生产 中的应用 酶是现代高效清洁剂的成分之一。酶在清洁剂中最大的功能就是使清洁剂更温和无害 。早期的自动洗碗机的清洁剂非常粗糙，容易在进食时对人体造成伤害，而且对陶瓷、木质餐具也会造成损害。而将酶制剂用于清洁剂以后 ， 可以在较低的清洗温度下就到达很好的清洗效果。 1975 年 ，-淀粉酶开始用于洗衣粉中。现在 ， 几乎 90%以上的液体清洁剂中都含有 -淀粉酶 9。 1.4.4 在 医药行业 中的应用 从最早的 J. Takamine 博士第一个使用米曲霉进行 -淀粉酶工业生产，这一淀粉酶被称之为塔卡淀粉酶作为一种助消化剂开始，淀粉酶在医药行业的应用主要是作为助
17、消化剂 10。黑曲霉 -淀粉酶因具有耐酸性 ， 适用于 制造助消化的药物 ， 开发适合于胃酸性环境 (pH2. 0 左右 )的耐酸性 -淀粉酶 ， 用于制备消化助剂 ， 将会使医疗效果更为有效 11。另外分析血链球菌群中的细菌与 -唾液淀粉酶的结合能力 ， 可有效鉴定不同血链球菌群中各菌株。研究唾液 -淀粉酶与致龋血链球菌粘附的关系 ， 为龋病的病因学研究和预防提供了理论依据 12。 4 2 实验部分 2.1 材料 、试剂和仪器 2.1.1 生物材料 实验室筛选得到的产淀粉酶菌株 。 2.1.2 主要试剂 10 Buffer， Dntpo， Taq DNA酶 (上海生工生物技术有限公 司 )；
18、 16SrRNA序列通用引物， 16SrRNA1： AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAAC 16SrRNA2 ： TACGGTTACCTTGTTACGACTT CACCCC； Lowry法测蛋白含量试剂盒 (上海荔达生物科技有限公司 )；其他试剂均为国产分析纯 。 2.1.3 培养基 配方 发酵培养基： 可溶性淀粉 10g，蛋白胨 5g， MgSO47H2O 1g， KH2PO4 4g， (NH4)2SO4 2g， NaCl 4g，蒸馏水 1000mL， pH自然，在 121灭菌 20min。 2.1.4 主要仪器和 设备 主要仪器和设备如表 2-1 所列： 表 2-1 主要仪
19、器和设备 名称型号 制造商或产地 YXQ-LS-SII全自动立式电热压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 电子天平 FA1104N 上海精密科学仪器有限公司 冰箱 JinsongBCD-B5 杭州金松优诺电器有限公司 Nikon YS100显微镜 尼康映像仪器有限公司 HD-910组合式全温度振荡培养箱 太仓市博菜特实验仪器厂 722型可见分光光度计 上海棱光技术有限公司 H2050R台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心设备有限公司 KD-S24电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 EPS300电泳仪 上海天能科技有限公司 HE-120电泳槽 上海 金鹏分析仪器有限公司 LG2020
20、凝胶成像系统 杭州郎基科学仪器有限公司 MG96PCR扩增仪 杭州郎基科学仪器有限公司 5 VS-1300洁净工作台 苏州市苏信净化设备厂 2.2 实验方法 2.2.1 菌种活化和培养 制 牛肉膏蛋白胨 培养基斜面数支，在无菌操作的条件下，将实验室保藏的待测菌株小心接至斜面上， 37 进行 活化培养。活化后的菌种斜面，除需使用的以外，其余可以放置于 4 冰箱保藏。 2.2.2 菌落及生理生化特性鉴定 经过固体培养基平板培养，观察菌落特征，经过制片镜检。进行革兰氏染色 观察细菌形态，测量菌体大小。根据常见细菌系统鉴定手册对菌株进行形态学和生理生化鉴定 13， 14，在此基础上通过分子鉴定确定其种
21、属。 2.2.3 菌种的分子鉴定 (1)用溶解酶 法提取 基因组 DNA。 (2)DNA琼脂糖凝胶电泳： DNA样品中按照 6： 1的比例加入 10凝胶加样缓冲液（ loading-buffer），与 DNA样品充分混合，加入加样孔。 (3)16SrRNA序列 PCR扩增 反应： 扩增反应在 25 L反应体系中进行（见表 2-2）。反应程序 ： 94预变性 5 min； 94 变性 1min， 52 退火 1 min， 72 延伸 1.5min， 30个循环 ； 72 延伸 10min 15 ，4保存 。 (4)PCR扩增 产物的检测及序列分析： 取 1 L PCR扩增产物与 6 L加样缓冲液在 1 %琼脂糖凝胶上电泳检测。 将测序结果 用 Blast软件在 GenBank中进行同源性比较，采用 MEGA 4.0 软件中 相邻连接方法 (Neighbor Joining Method)获得系统进化树，通过自举分析 (Boost rap)进行置信度检测，自举数据集为 1 000次。 表 2-2 PCR 反应体系 试剂 用量 10xPCR buffer 2.5uL 25mM MgCl2 2.5uL 10x dNTP 0.5uL 正向引物 2.0uL 反向引物 2.0uL Taq 酶 0.5uL DNA 摸板 1.0uL 无菌水 14uL
