1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要： ：本文利用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统构建了含有丙型肝炎病毒结构蛋白编码基因的重组杆状病毒， 并获得 HCV 结构蛋白在昆虫细胞 Sf9 中的表达。具体操作步骤如下：用 PCR 扩增 HCV结构区基因，克隆到杆状病毒表达载体 pFastBac l 中，构建成重组转座载体 pFB1-CEE，转化DH10Bac 大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性菌落，抽提大分子质粒 DNA，获得含 HCV 结构区基因的重组杆状病毒穿
2、梭载体 Bac-CEE，脂质体介导转染 Sf9 昆虫细胞，出现细胞病变后，收集含有重组杆状病毒颗粒的培养上清，重新感染 Sf9 细胞，收集 Sf9 细胞，进行 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见表达的蛋白条带。 HCV 结构蛋白在昆虫 细胞中的高效表达将为进一步研制适用于人的 HCV 预防性疫苗打下工作基础。 关键词： HCV 结构蛋白；杆状病毒表达系统； II Expression of Hepatitis C Virus Structural Proteins in Insect Cell Using the Baculovirus Expression System Abstr
3、act: In this work， a recombinant baculovirus containing Hepatitis C virus (HCV) structural protein coding sequence was constructed by Bac-to-Bac recombinant baculovirus expression system and it was proved to be able to produce HCV structural proteins directly in insect cells In this experiment HCV s
4、tructural gene was amplified by polymerase chain reaction(PCR)， and was inserted into baculovirus expression vector pFastBac1 to construct a recombinant tansposing vector pFB1-CEE.The plasmid pFB1-CEE was transformed into DH10Bac competent E.coli cells. High molecular weight DNA was prepared from th
5、e overnight cultures from the selected E.coli colonies， which was recombinant baculovirus shuttle vector containing HCV structural gene， named Bac-CEE. Spodoptera fragiperda (Sf9)insect cells were transfected with the recombinant Bac-CEE vialipofectin.Fresh insect Sf9 cells were infected with the re
6、combinant virus to express the target protein.The structural Protein recovering from the Sf9 cells exhibited Protein stripe.The expressing HCVstructural protein in this experiment will make further development for HCV preventive vaccine study. Keywords: HCV structural protein; baculovirus expression
7、 system III 目 录 摘要 I AbstractII 1 绪论 . 1 一 杆状病毒的分子生物学特性 . 1 二 杆状病毒的基因工程原理 . 1 三 杆状病毒表达系统的研究进展 . 2 四 杆状病毒表达系统的优越性 . 3 五 杆状病毒表达系统在 HCV 基因工程疫苗中的应用前景 . 3 2 实验材料 . 5 2.1 细胞株、菌株和质粒载体 . 5 2.1.1 Sf9 细胞 . 5 2.1.2 大肠杆菌 . 5 2.1.3 质粒 . 5 2.2 主要试剂及配制 . 5 2.2.1 分子生物学试剂 . 5 2.2.2 生化试剂 . 5 2.3 培养液及培养基 . 6 2.3.1 LB
8、培养液及 LB 平板 . 6 2.3.2 Grace， s 昆虫细胞培养液 . 6 2.4 碱法提取质粒主要试剂 . 6 2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 . 6 2.5.1 30%(W/V)聚丙烯酰胺溶液 . 6 2.5.2 聚丙烯酷胺凝胶电泳缓冲溶液 . 7 2.6 其它主要试剂 . 7 2.7 血清标本 . 7 2.8 实验仪器 . 7 3 实验方法 . 8 3.1 引物合成及 HCV 结构蛋白区 (C-EL-E2)基因片段的扩增 . 8 3.1.1 引物设计 . 8 3.1.2 HCV 结构区基因的 PCR 扩增及产物的纯化 . 8 3.2 重组转座载体的构建 . 9 3.2.1
9、 酶切反应 . 9 3.2.2. 目的片段 (C-El-E2)及转座载体 pFastBac1 的回收纯化 . 9 3.2.3 目的片段与转座载体 pFastBac1 连接 . 9 3.2.4 制备感受态大肠杆菌 DH5及 DH5的转化 . 9 3.2.5 重组转座载体 pFB1-CEE 的酶切鉴定 . 9 3.3 重组杆状病毒穿梭载体的获得 . 10 3.3.1 制备三抗平板 : . 10 IV 3.3.2 制备感受态大肠杆菌 DH10Bac . 10 3.3.3 重组 pFB1-CEE 转化进入感受态大肠杆菌 DH10Bac (转座 ) . 10 3.3.4 重组杆状病毒穿梭载体 Bac-C
10、EE DNA 的提取 . 10 3.4 重组杆状穿梭载体病毒 BAC-CEE 的 PCR 鉴定 . 11 3.4.1 引物 : . 11 3.4.2 PCR 反应 : . 11 3.5 重组杆状病毒穿梭载体 BAC-CEE 转染 SF9 细胞 . 11 3.5.1 转染 Sf9 单层细胞 . 11 3.5.2 重组杆状病毒的收获与保存 . 11 3.6 感染后 SF9 细胞的收集 . 12 3.7 SF9 细胞表达的 HCV 结构蛋白的特性分析 . 12 3.7.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 . 12 3.7.2 表达蛋白的抗原性初步测定 . 12 4 实验结果 . 12 4.1 HCV
11、 结构蛋白区 (C-EL-E2)基因片段的 PCR 扩增 . 12 4.2 重组转座载体的构建 . 13 4.3 重组转座载体 PFB1-CEE 的酶切分析 . 14 4.4 重组杆状病毒的获取 . 14 4.5 重组杆状病毒 BAC-CEE 的鉴定 . 14 4.6 正常 SF9 细胞形态和 BAC-CEE 转染后 SF9 细胞的形态变化 . 15 4.7 重组蛋白的 SDS-PAGE 分析 . 15 4.8 表达蛋白的抗原性检测 . 16 5 结论 . 16 参考文献 . 16 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪 论 多年来，丙型肝炎疫苗一直是国内外学者的研究热点。然而，丙型肝炎
12、疫苗研究面临 3 个难题： (1)HCV 复制力差，不易传代培养，免疫原不易大量制备； (2)HCV 基因具有高变异性，且 HCV编码的一些蛋白质与 HCV 的致癌性相关； (3)HCV 具有严格的宿主限制性，迄今为 止，黑猩猩是已知的除人类外唯一对 HCV 易感的物种。而昆虫杆状病毒表达系统能很好的解决这些问题。 一 杆状病毒的分子生物学特性 杆状病毒是一类双链 DNA病毒，其 DNA是 9.0 l04-2.3 105bp的环状分子 AcNPV和 BmNPV的 DNA分子为 1.35 105bP左右 1，病毒粒子呈杆状，其感染宿主细用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白胞后能够产生两种类型的
13、病毒，一种是包涵型病毒 (OV)，又称多角体获得病毒 (PDV),另一种是芽生型病毒 (BV)，或称胞外病毒 (ECV)。在感染的细胞核中，一部分核衣壳外 形成囊膜，多角体或颗粒体蛋白沉积于囊膜上，形成包涵体病毒。另一部分核衣壳通过出芽的方式从细胞质膜获得囊膜，形成芽生型病毒。包涵体衍生的病毒主要进行昆虫之间的感染传播，而芽生型病毒则负责昆虫体内感染的扩散。包涵型病毒和芽生型病毒在基因组层次上完全一致，但由于囊膜获得方式的不同，其分子组成略有差别，主要是囊膜糖蛋白不同，芽生型病毒的糖蛋白为 gp64，而包涵型病毒是 gp41，由于糖蛋白在病毒识别受体和侵染细胞中起重要作用，因此包涵型病毒和芽生
14、型病毒对不同组织细胞有不同感染力 :包涵型病毒对肠中细胞感染力强，适于对昆 虫进行喂食感染，而芽生型病毒对体腔中细胞感染力强，感染虫体时须经体腔注射。 二 杆状病毒的基因工程原理 杆状病毒体外培养系统的建立和完善，促进了杆状病毒分子生物学研究的巨大发展。杆状病毒编码的蛋白有二十多种，但其作为表达系统的主要吸引力源于其编码的多角体蛋白基因，它在病毒感染的昆虫细胞中，在复制循环的后期表达产生大量的多角体蛋白 (28-30KD)，此蛋白在正常的感染循环中被用以将病毒粒子包装在包涵体或多角体内起保护作用，其含量占感染细胞蛋白总量的 20-50%2，这一高比例在真核细胞中是相当少见的。经研究 ，多角体对
15、于昆虫口服感染是必需的，但对于在体外细胞中维持病毒的感染是非必需的。通过多角体基因编码区的缺失实验证实，不产生多角体蛋白 (Pn)并不影响培养细胞的感染性，非包涵粒子 (ECV)在感染循环晚期形成。这样，从逻辑上讲，可用外源基因替代多角体基因编码区，利用 Pn 启动子带动外源基因在昆虫细胞中高效表达。杆状病毒基因工程最基本的途径就是利用其 Pn 启动子带动目的基因，构建含有目的基因表达结构而缺失 Pn 基因编码区的重组病毒，通过这种重组病毒感染昆虫细胞或虫体，获得所需表达的蛋白。 smith 等 1983 年首先发表了用 AcNPv 载体在 Sf9 中高效表达 -人干扰素的研究成果，2 接着
16、Maedal985年也发表了用 BmNPV作载体在家蚕细胞和家蚕虫体中高效表达人 -人干扰素的结果。这些工作开拓了杆状病毒基因工程的新领域。 杆状病毒的另一特点是基因组较大，具有多个天然启动子，也易于构建新的人工启动子，可实现多基因表达。杆状病毒除 Pn 启动子外还有 PIO、 PE、 P6.9、 ETL 启动子，用于外源基因的表达，这些启动子的特点各不相同。 P10 基因与 Pn 基因一样，与多角体形成有关，对病毒复制是非必需基因，用 P10 启动表达外源基因，其表达水平与 Pn 启动子相当。 PE 基因编码的蛋白与多角体膜相连，也是病毒复制的非必需基因，但 PE 基因启动子表达水平仅为 P
17、n、 PIO 启动子的 1/50。P6.9 基因启动子的表达水平也很高而且开始表达较早，但它是病毒复制的必需基因，Hill-perkins3等在多角体蛋白基因位置处复制了一个 P6.9 启动子用来带动外源基因，同时保持原 P6.9 基因不变，取得较好的表达效果。 Thiem 等构建了一个融合启动子，含有 P39 基因启动子与一部分 Pn 启动子，结果表达外源基因时，表达水平高。 wang 等根据晚期高效表达的启动子序列，设计了一个 人工启动子，表达效果很好。从以上研究结果可以看出，杆状病毒对外源基因的容量很大，可以同时插入多个外源基因。 Emery 和 Bishop(1987)最早构建了双基因
18、表达载体，用两个 Pn 启动子分别启动两个基因表达 .French 与 Roy(1990)利用这一系统在昆虫细胞中同时表达蓝舌病毒 VP3 和 VP7，结果在感染昆虫细胞中形成了蓝舌病毒样颗粒。 Cameron(1989)则用了异源病毒 MbMNPV(甘蓝夜蛾核型多角体病毒 )的 Pn 启动子，与 AcNPV 的 Pn 启动子一起组成双基因表达载体。 Weyer 等将 P10 启动子转移到 Pn 基因旁边并不影响这两个基因的表达水平，构建了用 P10和 Pn 启动子的双基因转移质粒。近年来，已经有一些杆状病毒包含了一个不依赖于连接克隆技术(LIC)的重组体系 4-6。 多基因表达载体系统除了可
19、以方便的表达外源基因外，还给病毒筛选和杆状病毒载体基因工程疫苗的生产带来方便。在多基因表达系统中，可以用一个启动子带动表达报告基因 (report gene)，如对 -半乳糖苷酶基因进行蓝白斑筛选。 Vlak等构建了用 P10启动子带动外源基因， hsp70启动子带动 -半乳糖苷酶， Pn 基因保持完整的重组病毒。该病毒感染细 胞后，除表达外源基因外，还能很方便的筛选，同时能形成多角体，便于感染昆虫虫体 7-8。 三 杆状病毒表达系统的研究进展 杆状病毒发展成一种哺乳动物基因转移载体昆虫杆状病毒表达载体系统的研究始于上世纪80 年代，是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统后建立起来的又一高效
20、表达系统。目前用作表达载体的杆状病毒均为核型多角体病毒，以苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒为代表。由于其宿主特异性，一般认为该种高表达载体仅限于介导外源基因在昆虫3 细胞内表达，在非受纳细胞中不能发挥作用。然而 1983 年， Volkman 等。 发现 AcNPV 能够侵入一些脊椎动物细胞系中，同年和次年， Groener 和 TjiaH 等也分别发表文章报道 AcNPV 可以侵入哺乳动物细胞。此外，在上述三例报道中均未检测到子代病毒产生，亦无病毒基因组复制表达。以上研究结果表明杆状病毒可以侵入哺乳动物细胞，但是其病毒基因组在哺乳动物细胞中不能复制和转录。这些研究为将杆
21、状病毒发展成为介导外源基因进入哺乳动物细胞表达的新型基因转移载体提供了理论依据 9-10。 四 杆状病毒表达系统的优越性 杆状病毒的衣壳和基因组大，可容纳 10kb 左右外源 DNA，不影响复制，还可同时进行多个外源片段的表达；应用晚期蛋白启动子，即使外源基因产物对细胞有毒性，也不影响表达水平，因为在外源基因表达之前，大部分病毒与宿主基因已被关闭，病毒已完成复制过程并释放出大量成熟的子代病毒；杆状病毒具有明显的宿主界限，对脊椎动物无致病性，也不能在脊椎动物细胞内复制表达，更不能整合，因此，重组杆状病毒可以被认为是遗传学上最安全的表达载体；多角体蛋白与 p10 基因是非必需片段，启动子均很强，既
22、为外源性片段提供插入位点，又可高水平表达外源基因，可称为超高效表达系统；外源基因插入多角体 蛋白基因的座位引起后者的缺失或失活，无多角体蛋白形成，失去了病毒粒子天然保护物 -多角体蛋白晶体，故重组病毒在自然环境下极易失活，不会造成对人的危害和对环境的污染，重组病毒不含包涵体，不在环境中长期存在，所以更为安全；昆虫细胞作为真核细胞能完成外源蛋白的一系列转译后加工修饰，表达产物的理化和生物学特性与天然产物相似；产量高，还能感染昆虫活体，高效表达。表达产物具有生物活性，大多数蛋白质表达后需在细胞中经过一定的修饰加工，输送到细胞一定的位置或分泌出来，才具有生物活性。昆虫细胞对蛋白质表达后修饰加工与哺
23、乳动物接近，能识别并正确的进行信号肤切除、多肤切割、高级结构形成、蛋白质定位、磷酸化、糖基化等反应，表达产物通常具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性和功能均与天然蛋白质相似，这是细菌表达系统所不具备的 11-13。 五 杆状病毒表达系统在 HCV基因工程疫苗中的应用前景 HCV 核心抗体在丙型肝炎病人中是较早出现的抗体，而且滴度较高，因此在临床检测中具有重要的地位。研究表明，核心蛋白能激发宿主细胞的 CTL 反应，因而在宿主对病毒的消除方面有着一定的作用。 HCV 包膜蛋白区基因变异性大，其抗体尤其是 E2 抗体一直被 认为是具有潜在保护性的抗体。因此，近年来国内外对 HCV 结构基因的研究
24、相当广泛与深入， 1991 年 Hijikata 首先用体外翻译的方法表达了 HCV 结构蛋白，并对其组成加以分析，随后，相继有利用大肠杆菌、昆4 虫细胞及哺乳动物细胞表达结构区蛋白的报道，对 HCV 结构基因的切割、加工、寻找抗原表位、中和抗体的研究都起到相当大的作用。原核系统表达的 HCV 重组蛋白或合成肽抗原多为线性抗原，缺乏依赖于多肤折登或翻译后加工才能形成的抗原表位。真核表达系统也存在细胞培养烦琐，表达量不高的缺陷。 杆状病毒表达系统其优点在于对人体安全 、外源基因插入容量大、强大的多角体启动子启动高表达、产物具有生物活性，此外带有外源基因的重组病毒可以直接感染昆虫幼虫并在体内大量表
25、达，表达量比细胞培养液高出几十乃至上百倍，而幼虫的大规模低成本的饲养大大降低了疫苗的制备成本。昆虫杆状病毒表达系统表达目的蛋白能装配成病毒样颗粒 (virus-like particles，VLP)，这已在一些非包膜病毒如微小病毒、环状病毒、杯状病毒及包膜病毒如 HCV 等研究中得到证实。表达的蛋白能装配成在形态上类似于野生病毒的空心颗粒，但颗粒内部不含病毒核酸，其本身不能复制，因此使 用安全，而且抗原性与野生病毒相同或相似，含有激发免疫反应的各种复杂的免疫原。该抗原以颗粒形式存在，便于抗原提呈细胞捕获，免疫后在体内存留时间长，能更有效地刺激免疫系统，具有强大的免疫性。有资料表明，病毒样颗粒疫
26、苗具有长期的保护作用，免疫效率高，其效果优于灭活疫苗和减毒活疫苗。目前己在蓝舌病毒、乳头瘤病毒、人类免疫缺陷病毒、轮状病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒等几种病毒的颗粒疫苗制备、免疫活性研究中取得了理想的效果。随着杆状病毒表达系统研究的进一步深入和多种抗原蛋白和免疫相关因子在这一系统成功表达和显示出的优越性 ，杆状病毒表达系统会更适于 HCV 基因工程疫苗的研究和应用14-15。 5 2 实验材料 2.1细胞株、菌株和质粒载体 2.1.1 Sf9细胞 由微生物教研室保存，在含有 10%胎牛血清的 Grace S 培养液中 27培养，当长满单层后，倾弃培养上清，加入适量的 Grace s 完全培养液，
27、用吸管轻轻吹打贴壁细胞使之完全脱落，混匀后分种至新瓶培养，通常一传三，每三天传代一次，用于重组杆状病毒增殖和蛋白表达。 2.1.2 大肠杆菌 DH10Bac:为 GIBCO/BRL 公司产品， DH10Bac 中含有穿梭载体 Bacmid 和辅助质粒 (helper Plasmid，含四环素抗性基因 Tetr)， Bacmid 上除含有 AcNPv 的全基因组外，还有一套转座 -穿梭盒，包括原核复制子 miniF，卡那霉素抗性基因 Kanr， -半乳糖苷酶基因片段 (Lac Z )， Tn7转座子的接受位点 att Tn7。辅助质粒提供的转座酶使外源基因插入 Bacmid 的 Tn7 att 位置，并使 Lac Z 插入失活。 DH5 :由微生物教研室保存，用于质粒的扩增。 2.1.3 质粒 pCV-J4:由微生物教研室保存，重组质粒 pCV-J4 是田克隆
