1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 甘草酸单钾盐制备工艺研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 ： 采用热回流提取法 ,从甘草中提取甘草酸 ,并利用正交试验设计考察提取温度、提取时间、提取剂用量 3因素对甘草酸提取率的影 响。结果表明 ,甘草酸的最佳提取条件是 :提取温度为92 ,提取时间为 2 h,提取剂用量为 10倍，收率为 5.1%。在最佳条件下提取甘草酸粗品，丙酮超声制备甘草酸三钾盐， 60冰醋酸热熔制备甘草酸单钾盐，收率为 18.6%。 关键词 ： 甘草酸单钾盐 ； 正交试验；提取工艺 II The Preparati
2、on Technology of Monopotassium Glycyrrhizinate Abstract: By heat reflux extraction method, extraction of glycyrrhizic acid from licorice, andinvestigated by orthogonal design of extraction temperature, extraction time dosage of 3 factorson the rate of extraction of glycyrrhizic acid. The results sho
3、wed that glycyrrhizic acid is the best extraction conditions: extraction temperature is 92 , extraction time 2 h, 10 times the amount of extraction agent, the yield was 5.1%. Under optimal conditions the crude extraction of glycyrrhizic acid, acetone, potassium ultrasonic three glycyrrhizin preparat
4、ion, 60 Glycyrrhetate acetic acid potassium salt melt preparation, the yield was 18.6%. Keywords: monopotassium glycyrrhizinate; Orthogonal experimental design; extraction 目 录 摘要 .I Abstract . II 1 绪论 . 1 1.1 选题的背景和意义 . 1 1.2 甘草酸的制备方法 . 1 1.2.1 传统提取方法 . 1 1.2.2 超声强化提取法 (ultra sound wave extraction,U
5、E) . 2 1.2.3 微波辅助提取法 (microwave assisted extraction,MAE) . 2 1.2.4 超临界流体提取法 (supercritical fluid extraction,SFE) . 2 1.2.5 负压空化法 . 3 1.3 纯化甘草酸的方法 . 3 1.3.1 反复结晶法 . 3 1.3.2 双水相萃取技术 (aqueous two phase extraction,ATPE) . 3 1.3.3 吸附树脂法 (absorption resin,AR) . 3 1.3.4 超滤膜分离法 (ultrafiltration membranesepa
6、ration,UMS)11 . 4 1.3.5 聚酰胺法 12 . 4 1.3.6 高速逆流色谱技术 . 4 1.4 研究进展 . 4 2 实验部分 . 7 2.1 材料和试剂 . 7 2.1.1 原材料 . 7 2.1.2 试剂 . 7 2.1.3 仪器 . 7 2.2 实验流程 . 8 2.3 实验方法 . 8 2.3.1 甘草酸粗品的制备 . 8 2.3.1.1 单因素实验 . 8 2.3.1.2 正交试验 . 9 2.3.2 甘草酸三钾 盐的制备 . 9 2.3.3 甘草酸单钾盐的制备 . 9 3 结果与分析 . 10 3.1 单因素实验结果 . 10 3.1.1 温度对甘草酸收率的影
7、响结果 . 10 3.1.2 液固比对甘草酸收率的影响结果 . 10 3.1.3 提取时间对甘草酸收率的影响结果 . 11 3.2 正交试验结果 . 12 3.3 产率 . 13 3.3.1 甘草酸三钾盐产率 . 13 3.3.2 甘草酸单钾盐产率 . 13 3.3.3 总产率 . 13 4 结论 . 14 参考文献 . 15 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 选题的背景和意义 甘草为豆科植物甘草的干燥根和茎，是极为重要的一味中药材 , 中医界素有 “ 十方九草 ” 之说。它不仅广泛应用在医药上而且也应用于食品、轻工业等方面。此外，甘草还具有防沙固沙，改良土壤等作用 1。
8、其有效成分可分为三萜类化合物和黄酮化合物 2大类。其中 ,甘草甜素是甘草酸及其盐的通称 ,属五环 三萜皂苷，含量为 6%-14%2。甘草甜素有广泛的药理作用 ,具有抗炎、抗病毒、保肝解毒及增强免疫功能等作用 ,临床上被用于治疗各种慢性肝炎 ,近年来 ,还被用于治疗肝纤维化等 3。 甘草酸单钾盐为甘草中主要有效成分甘草酸的单钾盐，甘草酸在水溶液中溶解度低，所以常把它制备成甘草酸单钾盐，国内外曾对其活性进行了广泛的研究。 甘草酸钾作为食品添加剂的高倍甜味剂我国早已批准列入了 GB2760国家使用卫生标准。可按生产需要适量应用于肉类罐头、调味料、糖果、饼干、凉果、饮料等食品。由于过去甘草甜受野生甘草
9、资源的限制以及价格 偏高，国内食品行业使用较少。在实际使用中，甘草甜不仅有甜味，还有增香作用。在糖果中使用时，有润喉、消炎、洁齿的作用；在面食加工中使用，有疏松、柔软、增泡的作用。 随着市场经济的建立 ,以及对甘草开发利用范围的扩大 ,甘草的需求量和出口量将急剧增长。甘草酸被列为重要的精细化工产品 ,国内外需求量都很大。近年来 ,甘草药材由于遭到过度采挖 ,资源急剧减少 ,保护甘草资源已迫在眉睫。国内有些生产厂家所用工艺落后 ,也不同程度地造成资源的浪费。 为此 ,摸索出一条切实可行的甘草酸单钾盐的制备工艺具有重要的意义。 1.2 甘草酸的制备 方法 1.2.1 传统提取方法 从甘草及其制品中
10、提取甘草酸的传统方法包括室温冷浸法、渗滤法、煎煮和热回流法以及索氏 (Soxhlet)提取法。 室温冷浸法是在室温条件下 ,将甘草粉末加入到适当的容器中 ,加入适当比例的水、氨水或醇等溶剂浸提 ,其提取的效率较低 ,时间相对较长 ;渗滤法需要使用特制的渗滤设备 ,不断加入溶剂 ,使之2 与渗出液一直保持一定的浓度差 ,提取效率较冷浸法高 ,但与冷浸法一样提取时间较长 ,溶剂消耗量较大 ;煎煮和热回流法是通过加热处理 ,增加甘草酸的溶解度和加快溶出速度 ,热回流法避免了乙醇等低沸点溶剂的挥发损 失提取效率较高 4。索氏 (Soxhlet)提取法又称连续回流提取法 ,其利用索氏提取器对甘草粉末进行
11、提取 ,加热蒸发的溶剂经冷凝后又回到样品管中 ,经约 10 个循环后 ,基本可将甘草中的甘草酸提取完全 ,提取效率较高 ,同时节省了溶剂 ,但时间相对较长。 1.2.2 超声强化提取法 (ultra sound wave extraction,UE) 超声波提取技术主要是利用超声波产生的强烈空化效应加速植物有效成分的浸出提取，另外它产生的机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等次级效应，也能加速提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合 ，利于提取。赵茜等 5以氨水为溶剂研究了超声介入强化提取甘草酸的作用效果 ,通过对施加超声场的功率、温度、浸渍时间、 pH 值以及搅拌速率等参数进行了研究 ,认为与未施
12、加超声场的传统方法相比 ,超声辅助提取可显著缩短提取时间 ,并获得较高的提取率。 1.2.3 微波辅助提取法 (microwave assisted extraction,MAE) 微波萃取 (MAE)技术是利用微波提高萃取率的一种新技术，其原理是在微波场中，吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基 体或体系中分离，进人到介电常数较小、微波吸收能力相对差的萃取剂中。潘学军等 6研究了微波辅助提取甘草酸的条件 ,发现当微波提取 45 min,w(乙醇 )=50%60%,w(氨水 )=1%2%,液固比为 10 1(mL/g)时 ,甘草酸的回
13、收率与热回流法、索氏 (Soxhlet)提取法、室温提取法等传统的提取方法相当 ,但 MAE 比传统方法更节约时间和溶剂 ,效率更高。 1.2.4 超临界流体提取法 (supercritical fluid extraction,SFE) 原理是通过调节压力和温度 ,使物质的气相和液相消失 ,形成超临界流体 ,溶解力和液体相似 ,但扩散系数接近气体 ,因此 ,可对中草药中的有效成分进行选择性提取 ,提取效率较高 ,提取液的杂质少 ,提取时间较短。通常使用的超临界流体为 CO2,其临界温度为 31.03 ,不需要加热就能将溶质和溶剂分开 ,无毒、高效、价廉 ,并具有灭菌功能。李巧玲等 7研究了超
14、临界流体技术萃取甘草酸的各种因素 ,并与冷浸法、热提法、超声波法提取甘草酸作了比较研究 ,结果表明 SFE 法的萃取率高于上述 3 种方法 ,而萃取周期大大缩短 ,并且节省提取溶剂。 3 1.2.5 负压空化法 近年来 ,由付玉杰等 8人为甘草 酸的提取研究出了一种全新的提取工艺 负压空化法提取工艺 ,它是利用负压空化气泡产生强烈的空化效应和机械振动 ,造成样品颗粒细胞壁快速破裂 ,加速了细胞内物质向介质释放、扩散和溶解 ,促进提取过程。由于在较短时间内负压空化的机械振动更为激烈 ,使得负压空化提取甘草酸的收率较超声法高 ,研究表明负压空化提取法对甘草酸的提取收率是超声提取法的 1.2 倍、索
15、氏提取法的 1.7 倍 ,同时负压空化提取法具有提取温度低、溶剂用量少、时间短和纯度高、提取效率高、易于操作的特点。适于工业化生产 ,为中药提取现代化提供了一种新的方法和手段。 1.3 纯化甘草酸的方法 由于应用上述方法提取的甘草酸粗提液中除含有甘草酸外 ,还含有许多杂质 ,如还原糖、胶质、蛋白质、淀粉、黄酮类等物质 ,要获得甘草酸纯品需要进一步除去这些杂质。目前 ,精制甘草酸的方法主要有酸沉反复结晶、双水相萃取、树脂吸附、超滤膜分离等。 1.3.1 反复结晶法 甘草酸粗提液加酸沉淀 ,再经乙醇或丙酮溶提 ,氨化成盐析出 ,再经活性炭脱色 ,反复结晶得到甘草酸纯品。 1.3.2 双水相萃取技术
16、 (aqueous two phase extraction,ATPE) 双水相萃取技术是利用被提取物质在不 同的两相系统间分配行为的差异进行分离。与传统水煎醇沉相比 ,ATPE 操作方便 ,条件温和 ,时间短 ,易于工程放大和连续操作。霍清等 9通过对 6 种双水相体系中不同种类盐分相能力及不同种类有机溶剂的分相情况进行研究 ,确定了萃取甘草酸的最佳双水相体系为乙醇 /磷酸氢二钾双水相体系。此体系收率可达 98.3%,且溶剂价廉、低毒、易挥发、易回收 ,操作中制备甘草酸单铵盐。 1.3.3 吸附树脂法 (absorption resin,AR) 吸附树脂法包括离子交换树脂和大孔吸附树脂两种方
17、法。其原理是利用树脂对甘草酸的选择4 性离子交换 或树脂对甘草酸及杂质的吸附能力差异 ,从甘草酸粗提液中选择性吸附甘草酸 ,然后用稀醇溶液从树脂柱中洗脱下来 ,从而分离纯化甘草酸。由于离子交换树脂处理量小 ,需引入可进行交换的酸性或碱性基团 ,提取效率较低。刘倩 10等考察了 4 种大孔树脂后 ,优选 AB-8 树脂进行甘草酸的分离实验 ,结果表明 ,在体积流量 1mL/min,pH=6.47.4,原液质量浓度 10 mg/mL 条件下 ,AB-8 树脂对甘草酸的吸附量最大 ,可达 120 mg/mL,洗脱比较容易 ,分离效果好 ,纯度可达 95%以上。 1.3.4 超滤膜分离法 (ultra
18、filtration membraneseparation,UMS)11 膜分离技术是发展较快的分离技术，其原理是以压力为推动力实现溶质与溶剂的分离 ,在常温下粗提液经过超滤膜 ,可将还原糖、蛋白、淀粉等大分子物质除去 ,然后对超滤液中的甘草酸进行沉淀或吸附纯化。该方法操作简单 ,无相变、能耗低 ,不需消耗过多的各种试剂和溶剂 ,提高了甘草酸的提取率。 1.3.5 聚酰胺法 12 潘福生等把甘草提取所得甘草酸粗品制成的单铵盐吸附在粉状聚酰胺上 ,先洗脱甘草酸单铵盐以外的杂质 ,再用极性溶剂洗脱甘草酸单铵盐 ,浓缩 ,再通过 强酸型阳离子交换树脂脱胺 ,从而制得甘草酸 (纯度可达 99.5%10
19、0%)。 1.3.6 高速逆流色谱技术 高速逆流色谱 (HSCCC)的原理是互不相溶的两相溶剂在聚四氟乙烯管内具有单相流体动力平衡性质 ,高速运转时一相溶剂作固定相 ,另一相作流动相。由于样品中各组分在两相中分配能力不同 ,在管中移动速度也不同 ,因而能在溶剂间反复分配进行分离 ,纯化、回收率高、运行成本低。最近 ,Jiang 等 13采用 HSSCCC 以 V(醋酸乙烷 ) V(甲醇 ) V(水 )=5 2 5 组成的两相溶媒一步法从甘草根中提取纯化甘草酸 ,下相作流动 相洗提 ,该方法提取率为 95.2%、纯度为 96.8%。由于不使用固相载体作固定相 ,克服了固相载体带来的样品吸附、损失
20、、污染和峰形拖尾等缺点。 HSCCC 技术不仅适用于粗提物去杂 ,还适用于最后产物的精制、纯化。 1.4 研究进展 张嫱等 14采用微波萃取设备，通过正交试验确定了最佳工艺条件以含氨 0.6%的 65%乙醇溶液5 为浸提溶剂，探讨影响微波辅助提取甘草酸的主要因素，最终确定微波辅助提取甘草酸的最佳工艺条件：固液比（ g/mL）为 1 9，微波处理时间 4.0 min，微波功率为中低火，提取次数 3 次。在此工艺条件下， 甘草酸的得率为 12.59%。微波化提取甘草酸能大大的减少提取时间，甘草酸得率也高于传统提取方法。 贾艳艳等 15研究超声波辅助萃取甘草中甘草酸的最佳提取工艺：药材浸泡 4 h,
21、用相当于药材重量 18 倍量的水 ,超声提取 3 次。超声波萃取 90min 甘草酸综合提取率劣低于渗漉提取 10 h,远高于加热回流 6 h。超声波辅助萃取具有快速、高效、节能的特点 , 张峻松等 16对常温下超高压提取甘草中甘草酸的工艺进行探讨。以甘草酸提取率为评价指标，考察提取时间、乙醇体积分数、液固比和超高压力对甘草酸提取率的影响。通过单因素试 验和响应面分析法确定最佳工艺条件：提取时间 15min，乙醇体积分数 49.50%，液固比 13:1，提取压力382MPa，甘草酸提取率的最大预测值为 14.61%。按最佳工艺验证试验 5 次，甘草酸平均提取率为 14.67%。超高压提取技术是
22、提取甘草中甘草酸的高效方法，具有提取率高、周期短、无污染、杂质溶出少。经超高压处理后，蛋白质、淀粉等已经变性，方便了溶液的分离、纯化。 李善家等 17采用超声强化提取和微波辅助提取 2种方法对甘草中的甘草酸提取工艺进行研究 ,以甘草酸得率为考察指标 ,通过正交试验设计 ,确定超声强化提取 和微波辅助提取各自的最佳提取条件 . 结果表明 ,超声强化提取的最佳工艺条件 :温度为 30 ,超声电功率密度为 80 W/cm2,超声作用时间为 90 min,酸化 pH 值为 1.0,优化后平均得率为 12.20%;微波辅助提取的最佳工艺条件是 :加入混合提取剂 (1/2 体积 10%乙醇和 +1/2 体
23、积 0.5%氨水 ),微波功率 550 W 加热 3 次 ,加热时间为 20 s,优化后平均得率为 10.77%.相比之下 ,超声强化提取得率略高于微波辅助提取 ,并且粗品纯度高 ,提取时间长 ;微波辅助提取作用时间短 ,但粗品纯度不高 .总体上考虑 ,超声强化提取 得率更加理想 . 付玉杰等 18人为甘草酸的提取研究出了一种全新的提取工艺 负压空化法提取工艺 ,它是利用负压空化气泡产生强烈的空化效应和机械振动 ,造成样品颗粒细胞壁快速破裂 ,加速了细胞内物质向介质释放、扩散和溶解 ,促进提取过程。由于在较短时间内负压空化的机械振动更为激烈 ,使得负压空化提取甘草酸的收率较超声法高 ,研究表明负压空化提取法对甘草酸的提取收率是超声提取法的 1.2 倍、索氏提取法的 1.7 倍 ,同时负压空化提取法具有提取温度低、溶剂用量少、时间短和纯度高、提取效率高、易于操作的特点。 Jiang 等 19采用 HSSCCC 以 V(醋酸乙烷 ) V(甲醇 ) V(水 )=5 2 5 组成的两相溶媒一步法从甘草根中提取纯化甘草酸 ,下相作流动相洗提 ,该方法提取率为 95.2%、纯度为 96.8%。由于不使用固相载体作固定相 ,克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。 HSCCC 技
