1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 海带多糖的提取工艺研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 海带 多糖的 提取工艺研究 摘要 ： 目的 本研究选用热水浸提法来提取海带多糖。方法 对影响热水浸提取多糖的 3个因素进行考察，即：温度、时间、料液比，在 3个水平上进行研究。结果 通过数据分析获得热水浸提取多糖的最佳方法，提取温度 80，料液比 1 60，提取时间 30min，即 ： A2B1C3。 关键词 ： 海带；多糖；正交试验 II Extraction and Determination of Polysaccharides fro
2、m Laminaria Japonica Abstract： Objective Hot-water method was employed to extract polysaccharides. Methods I optimized the extraction factors with L9(34) orthogonal experimental design. Results The results indicated that the optimum conditions were an extraction temperature of 80C, an extraction tim
3、e of 30 min and a substrate/liquid ratio of 1 60. Key words： laminaria japonica; polysaccharide; orthogonal experiment目 录 摘 要 I Abstract 1 绪论 （ 1） 1.1 海带 简介 （ 1） 1.2 海带多糖简介 （ 1） 1.2. 1 免疫调节作用 （ 1） 1.2. 2 抗肿瘤作用 （ 2） 1.2. 3 抗病毒作用 （ 2） 1.2. 4 抗菌作用 （ 2） 1.2. 5 消除自由基和抗氧化作用 （ 2） 1.2. 6 抗疲劳作用 （ 3） 1.2. 7 抗
4、高血脂 （ 3） 1.2. 8 降血糖作用 （ 4） 1.2. 9 其他一些生物活性 （ 4） 2 实验部分 （ 5） 2.1 材料和 试剂 （ 5） 2.1.1 仪器 （ 5） 2.1.2 试剂 和药品 （ 5） 2.2 分析方法 （ 5） 2.2.1 海带 多糖的 提取 （ 5） 2.2.2 海带多糖 含量的测定 （ 5） 2.3 实验操作 （ 6） 2.3.1 海带多糖 提取 （ 6） 2.2.2 海带多糖 提取量的测定 （ 7） 3 结果与分析 （ 8） 3.1 单因素试验 （ 8） 3.2 各条件对 海带多糖提取的 影响 （ 8） 3.2.1 提取温度的影响 （ 8） 3.2.2 提
5、取时间的影响 （ 9） 3.2.3 料液比的影响 （ 10） 3.3 正交试验 （ 10） 4 结论 （ 13） 致谢 （ 14） 参考文献 （ 15） 1 1 绪论 1.1 海带 简介 1 海带是一种营养价值很高的蔬菜，每百克干海带中含 ： 粗蛋白 8.2 克，脂肪 0.1 克，糖 57 克，粗纤维 9.8 克，无机盐 12.9 克，钙 2.25 克，铁 0.15 克，以及胡萝卜素 0.57 毫克，硫胺素（维生素 B1） 0.69 毫克，核黄素（维生素 B2） 0.36 毫克，尼克酸 16 毫克，能发出 262 千 卡热量。与菠菜、油菜相比，除维生 素 C 外，其粗蛋白、糖、钙、铁的含量均高
6、出几倍、几十倍。海带具有复杂的、多方面的生物活性 ， 特别 是 海带 多糖 。 1.2 海带多糖简介 海带的大部分生物活性和其主要成分多糖密切相关。近年来，有关海带多糖类的化学结构、 生物活性、应用及其在医学和药用价值等方面的研究都取得了很大进展。 至今已发现海带中有三种多糖，即褐藻胶 (align)、褐藻糖胶 (fucoidan)和海带淀粉 (laminaran) 。褐藻胶和褐藻糖胶是细胞壁的填充物质；海带淀粉存 在于细胞质中。褐藻糖胶主要成分是 -L-岩藻糖 4-硫酸酯的多聚物，同时还含有不同比例的半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸和少量结合蛋白质。海带淀粉是由葡萄糖组成的葡聚糖，主要由 1,3-糖
7、苷键连接而成。海带中还含有少量的粗纤维，结构上也是以纤维二糖为分子的重复单位。 海带多糖的生物活性多样，主要有以下几种： 1.2.1 免疫调节作用 多糖能在多个层面、多条途径对免疫系统发挥调节作用。包括对各类免疫细胞的调节、 对细胞因子的调节、对补体的调节等。 1.2.1.1 对 免 疫 细 胞 和 细 胞 因 子 的 调 节 海 带 粗 多 糖 (100mgkg-1)2 和 海 带 酸 多 糖(510mgkg-1)3能恢复由环磷酰胺引起的免疫低下小鼠的免疫功能。海带淀粉和海带淀粉硫酸酯 4可促进淋巴细胞的转化，促进 3H2TdR 和 3H2UR 掺入淋巴细胞，并表现出与植物血凝素 (PHA)
8、的协同作用，在 C3H/ HeJ 小鼠中海带多糖导致腹膜巨噬细胞分泌细胞因子白介素 -1 和释放肿瘤坏死因子 5；以上表明海带多糖具有增强细胞免疫的功能；可增加免疫低下小鼠血清和脾细胞溶血素的含量，对体液免疫也有促进作用；在 C3H/HeJ 小鼠中海带多糖对脾细胞 DNA 合成有促进作用；海带多糖部 分还可提高脾细胞中多克隆抗体 (IgG、 IgM)的产生。海带多糖是一种免疫调节剂，其作用强度与香菇多糖和枸杞多糖相近 3,证明它是一种对巨噬细胞、 T 细胞有直接作用的免疫调节剂。其中海带淀粉和海带淀粉硫酸酯对机体的免疫功能有促进作用，后者是前者人工磺化而成，对机体免疫功能的作用较前者弱，这可能
9、是海带淀粉经磺化后，降低了对网状内皮系统的刺激而2 减弱腹腔巨噬细胞的吞噬功能 4。 1.2.1.2 对补体系统的作用 补体过度激活，不仅会消耗大量的补体成分，使机体抗感染的能力下降，而且在激活过程中产生大量的具有生物活性 的物质，会导致机体发生过度的炎症反应而引起自身细胞和组织的损伤 6。通过海带水溶性多糖对补体旁路 (APC)作用的研究，发现 20gL-1褐藻糖胶可对红细胞溶解产生 50%的抑制，但褐藻糖胶硫酸化的程度并不影响其对 APC 的作用 7。 1.2.2 抗肿瘤作用 多糖抗肿瘤作用的免疫学机制，除了其本身具有直接抑制肿瘤细胞生长外，还可能通过增强机体免疫功能，抑制肿瘤细胞生长扩散
10、。昆布多糖、羊栖菜多糖、海蒿子多糖等 8 种多糖制成的复方海藻多糖是具有前途的抗癌中药制剂 8。目前，日本的学者从海带中分离并纯化了有效成分 ，例如含量仅占 4%的褐藻糖胶，可以阻止癌细胞生长，并引起肿瘤细胞凋亡。经多次腹腔注射，海带多糖具有体内抗小鼠肉瘤 S180 的活性， 20mgkg-1 14d 抑制率在 35%以上，并可增加接种肉瘤小鼠的脾脏重量 9。海带对 Ehrlich 癌的抑制率在 57.6%1。包含硫酸化岩藻糖的多糖或其降解物可用做凋亡诱导剂和抗癌药。在对肝癌细胞 QGY7703 的研究中发现褐藻糖胶抑制了癌细胞进入对数生长期，从而遏制了肿瘤的增长，并且不同浓度的褐藻糖胶对肝癌
11、细胞的杀伤效果不同，随剂量增大，杀伤效果越明显。结果说明褐藻糖胶的 抗肿瘤效应至少包括它们直接杀伤肿瘤细胞的途径 10。研究对 Hepes 瘤株的抑制作用，发现有的组分抑瘤率超过 50%，且不影响小鼠的正常生长，从而表现出比阳性药物的优越性 11。 1.2.3 抗病毒作用 海带多糖具有抗 HIV 的作用 2。从海带中水提取得到的多糖以 50mgL-1、 0 、 2h 作用于HIV，并与淋巴细胞温育 3d，则不存在抗原阳性的细胞，病毒的逆转录酶活性被 501000mgL-1的多糖强烈抑制 12。而褐藻糖胶则具有抗 RNA 和 DNA 病毒的作用，实验表明，它对脊髓灰质炎病毒型，柯萨奇 B3 和
12、A16 型病毒，腺病毒型，埃可型病毒有明显的抑制作用 13。 1.2.4 抗菌作用 海藻中所含抗菌活性物质的活性有显著的季节性变化。海带类型以冬季活性最高 1。褐藻酸银 14是由海带中的褐藻酸钠制备的，抗菌活性是通过测定 600nm 时液体培养液的光吸收值确定的，实验菌为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，发现 pH 为 7 时生长旺盛，但当该盐的加入大于 0.6%时生长被抑制。 1.2.5 消除自由基和抗氧化作用 抗氧化剂活性的发现提高了海藻作为食品和添加剂的价值 15。海带热水提取物 (标记为 SPh)3 和冷水提取物 (标 记为 SPc)对超氧化物自由基和羟基自由基的清除有显著作用，且呈量效关系，
13、前者的效果比后者好。在次黄嘌呤 /黄嘌呤氧化酶体系中只用 3gL-1 的 SPh 就可完全清除氧自由基，30gL-1 的 SPc 可清除 68.9 %的超氧化物自由基， 15gL-1 的 SPh 和 30gL-1 的 SPc 对羟基自由基的清除分别为 77.7%和 68.7%16。褐藻糖胶 (fucoidan，简称 FPS)治疗慢性肾衰，对中早期肾衰效果好，无毒副作用，特别对改善肾功能，提高肾脏对肌酐清除率效果尤为显著，现已按国家二类新药获准进入临床研究。有学者研 究表明海带粗提物和褐藻糖胶可对自由基攻击肾时产生保护作用17 20。在海带中加入褐藻糖胶会增加某些抗氧化酶的活性，减少自由基的产生
14、，从而减轻自由基对肾的攻击。还有的学者通过将褐藻糖胶进行酸水解得到的相对低分子质量片段与褐藻糖胶进行抗氧化能力的对比，从而得出相对分子质量以及分子组成对抗氧化能力的影响 19。移植肿瘤细胞Sarcoma-180 后使肝组织中超氧化物歧化酶 (SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH2Px)的活性降低，表现为丙二醛 (MDA)的水平增加。推测海带多糖抗氧化作用可能与其抗肿瘤作用有一定的 关系 21。 1.2.6 抗疲劳作用 海带多糖可增加小鼠的负重游泳时间，有效降低游泳后血乳酸的含量 (P 0.01)，表明可推迟运动性疲劳出现和促进疲劳后的恢复 22。 1.2.7 抗高血脂 海带在肠道中能将食糜中
15、的脂肪带出体外，具有良好的降脂、降胆固醇的功效，能克服降脂药物的一些副作用，研究认为其组分褐藻胶、海带淀粉和褐藻糖胶都是重要的功能因子 23。 1.2.7.1 对脂酶活性的影响 海带多糖可提高脂酶活性，在褐藻糖胶中发现了引起脂蛋白脂酶释放的物质，静脉注射后伴随着刺激脂肪裂解的效果。但药效的强 弱并不依赖于多糖大分子硫酸化的程度 27。 1.2.7.2 对脂质代谢的影响，降低胆固醇，防治动脉粥样硬化 海带多糖多次灌喂，可明显抑制高脂血鸡血清总胆固醇、甘油三酯含量上升，并能减少鸡主动脉内膜粥样斑块的形成和发展 9。研究了给雄性小鼠 ICR 含 4%海带提取物的食物以及在前者基础上另外加入褐藻糖胶分
16、别对脂质代谢的作用。与对照组相比，褐藻糖胶组可使血浆中胆固醇的含量显著减少 13%17% ，低密度脂蛋白降低 20%25% ，高密度脂蛋白含量增加 16% ，使动脉粥样硬化指数减少，血浆中脂质氧化物浓度降低 25。海带褐藻糖胶 150mgkg-1 可显著降低高胆固醇小鼠血清中的总胆固醇水平，可有效预防小鼠高胆固醇血症的形成。海带淀粉硫酸酯也可降低胆固醇量并抑制冠状动脉粥样硬化病变 23、 26。所以，褐藻糖胶和海带提取物可以通过改善血脂代谢，防治动脉粥样硬化的发生。 1.2.8 降血糖作用 4 在研究海带多糖对糖尿病的预防和治疗 27 29中发现，海带多糖可降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的血糖，
17、且发现随多糖纯度提高其降糖作用增强。但当多糖相对分子质量太大时则不宜吸收27。由于四氧嘧啶引起高血糖是通过损伤小鼠胰细 胞，从而影响胰岛素的分泌而实现的，褐藻糖胶可能对胰岛细胞损伤有保护作用。给经四氧嘧啶诱导生成的糖尿病小鼠注射 10mgkg-1 及50mgkg-1 褐藻糖胶后，其血糖水平分别为注射前的 80.4%、 60.6% ，患病小鼠饮水量分别比阳性对照低约 36.2%、 50.6%，表明褐藻糖胶对缓解糖尿病小鼠症状，减少饮水量具有一定作用，糖耐量明显改善 31。海带淀粉对实验性糖尿病小鼠的预防和防治也有一定作用 28。另有关于 PSS 对糖尿病患者存在轻度降糖作用的临床报道 30。 1
18、.2.9 其他一些生物活性 还带多糖具有 抗凝血作用、辐射防护作用，另外，褐藻糖胶可以作为金属离子的结合剂和阻吸剂。耿美玉等 31研究发现，由海带中提取 GS-01 褐藻多糖对海马神经细胞和皮质神经细胞均有明显的营养作用，可提高神经细胞的存活率，并且呈一定的量效关系。 5 2 实验部分 2.1 材料和试剂 2.1.1 仪器 本实验所需 仪器 见表 2-1 表 2-1 器材 器材名 型号 厂家 旋转蒸发仪 RE-52AAA 上海嘉鹏科技有限公司 离心机 TDL-5 上海精密科学仪器公司 电子天平 PTRY-A 美国康州 HZ 华志科仪有限公司 紫外 分光光度计 752N 上海精密科学仪器公司 2
19、.1.2 试剂和药品 本实验所需试剂 和药品 见表 2-2 表 2-2 试剂 试剂名 分子量 密度 /g/ml/水溶性 沸点 / /熔点 规格 浓硫酸 98.08 1.8365 338 分析纯 95%乙醇 46.07 0.789 78.5 分析纯 蒸馏水 20.03 1.000 99.974 实验室自备 苯酚 94.11 1.071 182 分析纯 丙酮 68.08 0.7845 56.05 分析纯 2.2 分析方法 2.2.1 海带 多糖的 提取 将市购 的新鲜 海带洗净、风干、剪碎 、 待用。称取 1.0 g 左右剪碎后的海带 ，按一定液料比、浸提时间、浸提温度，在热水浴中回流浸提，冷却后过滤，离心，将清液浓缩至原体积的 1/4 后缓缓加入 95%乙醇至溶液浓缩后的体积的 3 倍，得到多糖沉淀。经离心分离后用丙酮洗涤 2 次，真空干燥后得粗品多糖。 2.2.2 海带多糖含量的测定 葡萄糖标准曲线的制作：
