1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 天然红色素抗菌性能的初步研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - 1 - 摘要 : 灵菌红素是具有多种生物活性的天然色素，在具有抗菌活性的天然功能染料的研究方面有重要意义 。本研究定性和 定量的考察了灵菌红素对常见细菌的抑菌性能，再进一步探讨了灵菌红素在不同的 PH、温度、接触时间条件下的抑菌稳定性。结果表明， 灵菌红素对枯草芽孢杆菌 、 金黄色葡萄球菌 、 铜绿假单胞菌 具有良好的抑菌效果， 对大肠杆茵抑制效果较弱 ，最小抑菌率分别为： 0.01g/L、 0.002 g/L、 0.005 g/L；抑
2、菌稳定性实验表明，灵菌红素在 PH 为 5-7 范围内具有较好的抑菌稳定性，温度为20-100内 表现出良好的抑菌稳定性。 关键词 : 灵菌红素；抑菌稳定性； MIC - 2 - Abstract: Prodigiosin is a secondary metabolites which produced by some microorgan- ism. As a natural pigment, it has some important biological characteristics such as bacterostatic activity, and played an impo
3、rtant role in medicine, environmental management, food, textiles, etc. We studied the antimicrobial activity of prodigiosin by qualitative and quantitative method in this research. The result showed the prodigiosins had good inhibition to B.subtilis, S.aureus and P.aeruginosa， the MIC was 0.01g/L,0.
4、002 g/L and 0.005 g/L respectively. The experiment of antibacterial stability indicated that the prodigiosins showed favorable antibacterial stability in different temperature, and when the PH of solution was between 5 and 7, the prodigiosins had good antibacterial stability. Keywords: prodigiosins;
5、 Antibacterial stability ; MIC - 1 - 目录 摘要 -1 Abstract-2 1 绪论 -1 1.1 灵菌红素的基本性质 -1 1.2 选题的背景及意义 -1 2 相关研究的最新成果动态 -2 2.1PG 的生物活性 -2 2.2 PG 的生产现状和发展趋势 -3 2.3 本课题的研究目的 -5 3 方法与材料 -4 3.1 实验材料 -4 3.2 实验方法 -5 4 结果与分析 -7 4.1 灵菌红素对不同微生物抑菌性能的研究 -7 4.2 最小抑菌浓度 MIC-8 4.3 灵菌红素抑菌的稳定性研究 -9 5 结论 -13 致谢 -14文献摘要 -15 -
6、 1 - 1 绪论 1.1 灵菌红素的基本性质 灵菌红素 (prodigiosins,PG)是一类天然红色素的总称，通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构， 1929 年由 Amak 等研究 Serratia 生长时发现，包括 prodigioSin， prodigio Sin 25-C， metacyc1oprodigiosin (MP)desmethoxyprodigiosi 和 uncedy1prodigiosin(UP)等。PG 属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶； PG 对温度稳定，但
7、受 pH的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大 1； A13+， Ca2+， K+，Ba2+等金属离子对 PG 的稳定性影响不大， Zn2+有使 PG 增色的作用， Mg2+和 Mn2+对 PG有一定的破坏作用， Pb2+可以络 PG，使之成为沉淀 2；白光和蓝光使 PG 发 生光解，在红光和远红光下 PG 则不会降解 3。 1.2 选题的背景及意义 天然色素是由天然资源获得的色素 ， 主要从动物和植物组织及 微生物 （培养）中提取，其中植物性 着色剂 占多数。天然色素不仅 颜色鲜艳 ，而且 大 部分天然色素具有 重要 生理活性 ， 具有增强人体生理机能的作用，且使用时无
8、毒副作用，安全性高 ，在食品、纺织、化妆品等行业具有重要的应用价值。 灵菌红素 (prodigiosin， PGs)又名灵菌素、灵杆菌素，是一类由微生物产生的天然红色素。自 1929 年 PG 首次从黏质沙雷氏菌中分离出来以后，人们对其的研究就一直在不断地进行当中。早期研究表明此类结构的物质具有抗细菌、抗疟疾，抗真菌和抗原生动物的活性。随着研究地不断深入，近年来研究者们惊奇地发现其还具有很强的免疫抑制活性和抗癌抗肿瘤活性，这引起了研究人员们极大地兴趣和关注。大多数抗癌药物由于靶向问题，对肿瘤细胞和人体正常细胞都具有杀伤作用。在治疗肿瘤的同 时对人的肝肾带来巨大损伤。不同于这些药物的是， PG
9、对 57 种不同的人癌细胞有抗性作用，而在相同的作用剂量下对正常细胞无任何毒害作用 【 4。鉴于此， PG 的研究具有了独特的优势并有着诱人的市场前景，正逐渐成为医学界抗肿瘤领域的新宠。 PG 最初是作为一种抗菌的物质来研究的，它具有抗细菌、抗疟疾，抗真菌和抗原生动物的活性。 PG 的体外抑菌试验表明，其对金葡球菌 (耐青、红霉素菌株 )和福氏志贺氏菌有很好的抑制效果 3I。 Cang 等 4以沙雷菌发酵生产的 PG 做抗菌实验，结果表明，对芽孢杆菌具有显著地杀灭作用。 PG 结构 类似物具有显著的抗 Trichophytonspp.等真菌的活- 2 - 性，在临床测试中表现出对 Coccid
10、mycosis 引起的一种地方性真菌传染病有良好的治愈作用。 灵菌红素作为一种由微生物产生的天然色素，兼具有多种优越的生物活性作用，目前已受到人们的关注。但主要研究还是集中在抗肿瘤和其生产制备工艺改进方面。随着人们生活水平的不断提高和科学技术的进步发展 , 人们对自身的卫生保健意识日益增强 , 制造具有抗菌功能的抗菌纺织品成为一种新热潮，而灵菌红素作为一种天然色素，又具有良好的抑菌性能，因而在天然染料的研究，特别是具有 抗菌能力的天然染料的研究方面具有特别意义。 随着 畜牧业规模化、商业化的发展 ，开发高效、无残留、无公害的安全饲料添加剂越来越受到人们的重视，灵菌红素作为一种微生物产的无公害天
11、然抗生素，有利于大规模生产，抗病原（微生物或寄生虫）活性强，且有抗癌、抗突变等作用，与传统的抗生素比较具有一定的优势，因此，其作为抗生素应用于饲料添加剂方面具有很大的研究价值。虽然灵菌红素在作为饲料添加剂等方面的研究还很少，还有待于深入研究，但其研究价值已经引起了关注。 本 课题将定性定量的考察灵菌红素对常见的细菌的抑菌性能，并进一步考察其在不 同条件下的抑菌性能的稳定性，对获得的灵菌红素的抗菌性能进行进一步研究，以期为灵菌红素在纺织业、化妆品、饲料产业上的推广应用提供理论基础。 2 相关研究的最新成果及动态 和应用前景 2.1 PG 的生物活性 （ 1） 抗肿瘤作用 Montaner 等 5
12、的研究表明， PG 能诱导人结肠腺癌细胞株 DLD-1 和 SW-620 及人胃癌细胞株 HGT-1 凋亡，对转移性肿瘤细胞株 SW-620 更为有效，其诱导结肠癌细胞凋亡呈剂量依赖性，主要表现为细胞收缩、染色质缩合、肌动蛋白微丝结构重组等。 （ 2） 免疫抑制剂活性 选择性免疫抑制包括在自体免疫性疾病治疗和临床器官移植中能抑制信号传递，预防T 细胞激活。临床上将 PG 与 CyA 结合用于解除器官移植急性排斥反应，作用效果好 6，对其潜伏期和临床应用有待进一步的研究。 （ 3） 抗菌作用 PG 具有抗细菌（ antibacterial）、抗真菌（ antifungal）的生物活性。 PG 结
13、构类似物具有显著的抗 Trichophytonspp.等真菌的活性 7，在临床测试中表现出对 Coccidmycosis 引起的一种地方性真菌传染病有良好的治愈作用 8。 - 3 - （ 4） 抗疟疾活性 PG 对引起查格斯疾病的锥虫（一种寄生虫）有很大的杀伤作用，其杀锥虫活性（ IC50=5 mol）是经典杀锥虫药 Nifurtimox 活性（ IC50=150 mol）的 30 倍。 PG 可作为生物农药用于防治 Botrytis cinerea 等引起的樱草属植物病害 . （ 5）抗肿瘤活性及其可能的作用机理 PG 具有有效的抗肿瘤活性，美国国立癌症研究所 (NSI)Melvin 等发现
14、 PG 在平均 ICso为 2 Ivmol L-1 时对包括白血病、肺癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、 卵巢癌在内的八种癌细胞株中的 57 种不同的人癌细胞均有抗性作用。研究者们认为 PG的这种抗癌特性与其诱导细胞凋亡的活性密切相关，目前就其机理提出了四种可能：作为 pH 调节器；作为细胞分裂周期抑制剂；作为 DNA 裂解因子；作为胞外信号调节激酶调节器 9I。 （ 6）抑制癌细胞浸润转移活性 癌细胞转移是造成癌症患者死亡的主要原因。 PG 可促进细胞浓集，同时抑制细胞附着于胞外基质 (ECM)并抑制癌细胞浸润转移 10l。 2.2 PG 的生产现状和发展趋势 以及应用前景
15、 当前 PG 的生产以生物合成为主。 PG 是微生物的次级代 谢产物，可由多种细菌和放线菌产生，包括链霉菌属 (Streptomyces)、沙雷氏菌属 (Serratia)和假单胞菌属 (Pseudomona5)，其中关于沙雷氏菌属 (Serratia)的研究最多。在对其代谢途径的研究发现， PG 是通过一条二叉的途径合成的 【 11】 。该途径的关键步骤是最后一步酶促缩合反应，即 2-甲基-3-戊基吡咯 (MAP)和 4-甲氧基 -2， 7-二吡咯 -5-羧甲基乙醛 (MBC)在酶的作用下缩合生成PG(Prodigiosin)【 12】 ，而催化此反应的关键酶是 PG 缩合酶 (Prodig
16、iosin condensing enzyme，PCE)E33l【 13】 。 随着 PG 应用的逐渐推广和其市场需求的不断增大，其合成研究也在不断发展。尽管全合成生产 PG 产量高且价格低廉，但相较于全合成，生物合成更具优势 【 14】 。通过生物合成生产 PG 安全可靠，符合人们对绿色天然的追求。然而，生物合成也有产量较低、分离困难等自身的缺点。因此，如何改造菌株，优化发酵工艺，寻求一条经济可行的生物合成 PG 的途径，将成为今后 PG 研究的热点。 综上所述，不难看出灵菌红素在抗肿瘤，抗菌方面具有良好的效果，已经引起很多关- 4 - 注和研究 15。其独特的抗菌性能和天然色素的生理属性，
17、可作为新型的饲料添加剂应用于畜牧业 16，作为天然染料及抑菌剂应用于抗菌纺织品的制造 17。但由于红色素的生理活性及一些生理特性还没有被人们彻底了解，对其抗菌、抗疟疾和抗原生动物等的作用机制有待进一步研究。红色素的研究方向多集中于医疗方面，其多种应用还有待深入研究拓展。还需要更加深入了解灵菌红素的产生和作用机制，解决未来需要的大量生产制备以及应用等方面的具体问题。相信不久以后灵菌红素必定可以造福人类。 本课题主要对其在细菌真菌的抑菌稳定性方面进行了初步的研究 ，从而为在这方面的研究提供一定的依据。 2 方法与材料 2.1 实验材料 2.1.1 菌种 沙雷氏菌 ( Serratia jx.1)，
18、本实验室保藏。 大肠埃希菌（ Escherichia coli），本实验室保藏。 金黄色葡萄球菌（ staphylococcus aureus），本实验室保藏。 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis），本实验室保藏。 铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa），本实验室保藏。 2.1.2 主要仪器与试剂 QYC-211 型全温空气摇床（上海福玛实 验设备有限公司）； H2050R 型台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）； VS-1300 型洁净工作台（苏州时速为净化设备有限公司）； PHS-3C 型精密 pH 计（上海安亨昌吉 149 号雷磁仪器厂
19、）； AL-204 型电子天平（梅特勒 -托利多仪器上海有限公司）； DGX-914381 型电热恒温鼓风干燥器（上海福玛实验设备有限公司）； LRH-250A 型生化培养箱 (广东省医疗器械厂）。 旋转蒸发仪 DK-S24 型电热恒温 水浴锅 （上海精宏实验设备有限公司） 752s 紫外可见分光光度计 移液枪 本实验所用丙酮 、氯化钠等均为分析纯； PN5247 蛋白胨、牛肉浸膏等均为生化试剂。 2.1.3 培养基 - 5 - 种子培养基 (g/L)：牛肉膏 3.0，蛋白胨 10.0， NaCl 5.0，琼脂 15， pH 7.4-7.6。 种子扩大培养基（ g/L）：蛋白胨 13.0，甘油
20、 20.0， Nacl 5.0，摇瓶装液量 20mL/250mL（ V/V）， pH 自然， 28 ， 170r/min，培养 24h。 发酵培养基 (g/L)：蛋白胨 16.0，甘油 20.0， MgSO4 1.2， NaCl 2.0， Gly 0.75， pH 5.7，摇瓶装液量 50 mL/250mL(V/V)，接种量 5 (V/V)， 28 ， 170r/min，培养 48h。 固体培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g， Nacl 5g，琼脂 1520g，水 1000mL， pH 7.07.2。 液体培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g， N
21、acl 5g，水 1000mL，pH 7.07.2。 2.2 实验方法 2.2.1 灵菌红素的制备 2.2.2 平板抑菌圈法定性测定灵菌红素对常见微生物的抗菌性能 待测菌种活化，制成了一定浓度的菌悬液。菌液含量采用分光光度计法及稀释法测定。取 0.1ml 菌悬液 涂布平板，再于平板中央加入经灵菌红素浸泡的滤纸片， 37 1倒置培养 24h，记录抑菌圈大小，初步判断抑菌效果。 2.2.3 液体倍数稀释法测定灵菌红素对各菌的 MIC 用液体倍数稀释法测定最小抑菌浓度（ Mininum Inhibitory Concentration MIC），即液体培养基按每管 3ml 分装试管，再加入不同量的灵
22、菌红素溶液，配成一系列浓度梯度的培一级摇瓶培养种 二级摇瓶培养 发酵液离心 去上清液 加适量丙酮振荡 再次离心 取上清液 黑暗通风处挥发丙酮 灵菌红素粗品 48h 28 4500 r/min 8min 4500 r/min 8min - 6 - 养基。每支试管培养基接种 0.15ml 的待测菌液，于 37恒温震荡培养箱中培养 24h，另取加入与灵菌红素等量的二甲亚砜试管作为对照。以肉眼观察培养基澄清，无细菌生长时的最低浓度为 MIC。 2.2.4 灵菌红素抑菌的稳定性研究 （ 1）不同 PH 值对灵菌红素抑菌性的影响 在 6 根试管中加入 3ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基，用 0.1%的柠檬酸和
23、 2%的 NaOH 溶液调节 PH 为 4、 5、 6、 7、 8、 9，再按待试菌种的 MIC 浓度加入灵菌红素溶液，接种待测菌悬液 0.15ml，将上述试管放入摇床， 37培养 24 小时，观察细菌的生长情况，确定灵菌红素在不同的 PH 条件下的抑菌稳定性。 （ 2） 不同温度对灵菌红素抑菌稳定性的影响 将灵菌红素溶液置于 20 度、 40 度、 60 度、 80 度、 100 度条件下水浴加热 30min，再分别加入 3ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种待测菌悬液 0.15ml，将上述试管放入摇床，37培养 24 小时，观察细菌的生长情况，确定灵菌红素在不同的温度条件下的抑菌稳定性。
24、（ 3）不同作用时间下灵菌红素抑菌性测定 将 1ml 的灵菌红素溶液和 0.1ml 的菌悬液混合，分别处理 1、 3、 6、 12h 后，将其倒入无菌平板涂布，以无菌水作为对照， 37 度倒置培养 24h，观察菌落生长情况，计算其抑菌率。 3 结果与分析 3.1 灵菌红素对不同微生物抑菌性能的研究 通过平板抑菌圈法定性测定灵菌红素的抑菌性，结果如图表所示。灵菌红素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌都有一定的抑制作用。而在这几种待试菌株中，灵菌红素对枯草芽孢杆菌的抑制能力最强，这与 Cang【 17】 等的实验结果一致，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌次之，而对大肠杆菌的抑制能力最弱。且对铜绿假单胞菌的抑菌圈出现内外两层，内层抑菌圈较小，无菌生长，外层抑菌圈较大，但是有一些稀疏的菌落分布，这可能与灵菌红素在培养基中的扩散有关。 表 1 灵菌红素对不同微生物抑菌性能的研究
