1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 天然色素生产菌的鉴定 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要： 黑色素是广泛存在于生物界中的一类色素，是头发、皮肤、昆虫表皮、植物、动物、真菌等表现黑色的本源。本研究主要是 从土壤中分 离得到一株产黑色素菌株，根据菌落形态和常规生理生化初步鉴定为一株放线菌。为了进一步确定该菌株在分类学上的位置，对其进行 16SrRNA的分子鉴定，结果显示：与链霉菌属的同源性为 98%。 关键词 ： 黑色素；菌种鉴定；测序 II Abstract: Melanin is a kind of pigment that
2、widely exists in biological. It is black source of the hair, skin, insect cuticle, plants, animals and fungi etc. The study investigated the strain producing black pigment was isolated from soil. The strain was identified by the shape and general physiological and biochemical properties. The result
3、showed the strain was actinomyces. In order to confirm the location in taxonomy, 16S rRNA sequence of the strain was sequenced and it had the similarity of 98 with that of the Streptomyces . Keywords: black pigment; strain identification; sequencing1 目 录 摘要 错误 !未定义书签。 Abstract 错误 !未定义书签。 1 绪论 错误 !未定
4、义书签。 1.1 黑色素的性质 1 1.2 黑色素生产 2 1.2.1 应用分离出的细菌 2 1.2.2 发酵生产 2 1.3 黑色素的代谢调 2 1.3.1 遗传 2 1.3.2 巯氢基（ -SH） 3 1.3.3 内分泌 3 1.3.4 紫外线 3 1.3.5 角朊细胞因子 3 1.4 实验研究的内容与难点 3 2 实验部分 5 2.1 实验材料、药品和器材 5 2.1.1 实验材料 5 2.1.2 实验药品 5 2.1.2 实验仪器 5 2.2 菌落及生理生化鉴定 6 2.3.1 菌种培养 6 2.3.2 基因组提取 6 2.3.3 凝胶电泳 8 2.3.4 PCR 扩增 8 2.3.5
5、 切胶回收 9 2 2.3.6 连接反应 10 2.3.7 感受态细胞的制备 10 2.3.8 转化反应 10 2.3.9 鉴定 11 2.3.10 质粒 DNA 的提取 11 3 结果与分析 12 3.1 菌落及生理生化鉴定 12 3.2 分子鉴定 12 3.2.1 基因组凝胶电泳图谱 12 3.2.2 PCR 扩增 13 3.2.3 转化反应 13 3.2.4 导入后的 PCR 扩增 14 3.2.5 质粒提取 14 3.2.6 基因测序 15 3.2.7 构建进化树 17 4 结论 18 参考文献 19 致 谢 21 1 1 绪论 1.1 黑色素的性质 黑色素是广泛存在于生物界中的一类色
6、素 ,它是头发、皮肤、昆虫表皮、植物、动物、真菌等表现黑色的本源 1。微生物所产黑色素主要分为胞内、壁结合和胞外黑色素 2。黑色素能作为紫外线吸收剂 3、抗氧化剂 4、自由基清除剂 5、阳离子螯合剂和新型天然的药物载体，也可以用来治疗与黑色素缺乏有关的神经系统疾病如着色性干皮病；具有体外抗 HIV 病毒的作用。 黑色素通常不溶于水、酸溶液和普通有机溶剂。黑色素的黑色是因为它吸 收所有波长的可见光。黑色素在紫外区的吸收率最高 , 随着波长的增加而逐渐降低，通常光吸收的降低与波长的增加是呈线性的。因此 , 光吸收线性曲线的斜率可作为鉴定自然来源黑色素的特征参数。研究者认为 , 不同类型的黑色素其光
7、吸收斜率值是不同的。但因黑色素氧化后斜率的改变而不能把其作为黑色素分类的依据 7。黑色素广泛存在于人体皮肤、眼睛及其它组织中 , 是目前所知道的唯一保护皮肤免受辐射伤害的天然生物聚合体 6。因此 , 它在医疗、食品和化妆品工业中的应用潜力巨大。已有研究证明了链霉菌所产黑色素对苏云金芽孢杆 (Bacillus thuringiensis 简称 Bt) 以色列亚种杀虫活性的光保护作用。国外学者对 Bt库斯塔克亚种进行连续的紫外诱变 , 得到了能产黑色素的 Bt突变株 8。目前已经报道了多种微生物可产生黑色素。 图 1 黑色素结构图（部分结构） HNNHOO-O-OC O O-HNC O O-NHO
8、OC O O-O-O2 1.2 黑色素生产 1.2.1 应用分离出的细菌 目前从武汉东湖中分离出一株高产胞外黑色素的细菌 (BFHM2002)。 BFHM2002 具有产黑色素速度快 , 产量高且不需要酪氨酸诱导等优点；而且经酪氨酸诱导可显著提高 BF2HM2002 胞外黑色素的产量 ,初步鉴定 BFHM2002 属坚强芽孢杆菌 (Bacillus firmus)。由于 BFHM2002 的产黑色素特性 , 它将成为芽孢杆菌属的一个新的菌种资源。 1.2.2 发酵生产 链霉菌是一种很重要的次生代谢物产生菌种，有可能通过基因工程方法 , 使同一菌种既能产生黑色素，同时又能产生某种抗生素，通过优化
9、其发酵条件，就可以一次发酵同时收获黑色素和抗生素，从而成倍地提高经济效。 一定范围内， OD400nm 值与溶液中黑色素含量成正比，可用于比较两个菌株的产黑色素能力 ,用酪氨酸诱导可显著提 高该菌株黑色素的产量 17。通过多种培养基摇瓶发酵实验，发现产黑色素量最高的可达到约 0.70g/L，比其它菌株产黑色素都快。其培养特征：在高氏培养基上生长良好，在酵母膏葡萄糖琼脂上菌落白色 , 直径约 1 mm, 表面绒毛状，并可产胞外黑色素。显微镜观察 :光学显微镜观察基质菌丝未见横隔膜 ,气生菌丝丰茂，且气生菌丝后期断裂。气生菌丝上长孢子丝 , 孢子丝紧密右手螺旋成假孢囊状 , 电镜下可见紧密的螺旋
10、, 孢子柱形，表面疣状 (见图 )。 图 2 在高氏培养基的培养菌丝 注： A: 8 天 , 60 倍 For 8 d, 63 /； B: 21 天 , 10 000 倍 For 21 d, 10 000 1.3 黑色素的代谢调节 1.3.1 遗传 遗传基因决定了皮肤的基本肤色。蓝眼晴红头发的极白的人种，黑素细胞内黑素小体极少，几乎没有第、期黑素化深的黑素小体，在角朊细胞内没有黑素，而在黑种人主要见到许多第3 期的黑素小体。 1.3.2 硫氢基 (-SH) 表皮中正常存在的 -SH 能与酪氨酸酶中的铜离子结合而抑制其机能 , 正常时 -SH 与酪氨酸酶间经常保持一定的平衡关系 , 任何使表皮中
11、 -SH 减少的因素均可使黑素形成增多。 1.3.3 内分泌 1. 垂体 : 中叶分泌的促黑素细胞激素 (MSH)能迅速激活酪氨酸酶 , 有认为 MSH 是通过细胞内环磷酸腺苷 (cAMP)的增高来激活酪氨酸酶的， cAMP 的增高也有利于黑素小体转运到角朊细胞中去。也有认为 MSH 能使血清中铜含量增加或使皮肤内 -SH 含量减少 , 故能使色素增多。促黑素细胞激素（ MSH）：有、两种，均为直链多肽类激素。为 13 肽，为 18 肽，产生 MSH 的细胞分散在垂体前叶， MSH 分泌受下丘脑促黑激素释放因子（ MRF）及促黑激素细胞释放抑制因子（ MIF）的影响。 2. 肾上腺 : 肾上腺
12、皮质激 素在正常情况下通过抑制垂体分泌 MSH 而使黑素形成减少 , 它还能减低黑素细胞对 MSH 的感受性。肾上腺髓质激素亦有抑制 MSH 的作用。 3. 性腺 : 黄体酮、雄激素 ,尤其是雌激素均能直接刺激黑素细胞产生黑素 ,也可能是由于这些性激素解除了 -SH 对酪氨酸酶的抑制作用而使色素增加。 4. 甲状腺 : 甲状腺素是氧化过程刺激剂，可促进黑色素形成过程中之氧化过程，或能使皮肤中 SH 减少 , 而使色素增多。 1.3.4 紫外线 作用：使皮肤中的 -SH 氧化破坏而增加酪氨酸酶的活性；直接刺激黑素细胞；发生光氧化作用使黑素细胞及黑素小体数 量增加，黑素化程度加深，并加速黑素小体的
13、转运。 1.3.5 角朊细胞因子 角朊细胞释放的细胞因子如碱性成纤维细胞生长因子、内皮素、干细胞生长因子等分子量高者能刺激黑素细胞的生长 , 分子量低者能促进树枝状突起的生长及黑素的合成 , 如 cAMP 参与则其作用提高 10 20 倍。 角朊细胞释放的白细胞介素 6 及肿瘤坏死因子对黑素细胞的生长和黑素的合成则有抑制作用。 1.4 实验研究的内容与难点 本课题研究的内容是：筛选产黑色素的菌株；提取其基因组 DNA；采用通用引物，扩增 16sRNA片段；对扩增产物进行测序，在数据库 中进行对比，确定该菌种属及其亲缘关系。 4 该课题在进行实际操作时，主要的难点是基因组 DNA的纯度难掌握和
14、PCR过程中条件的掌握，因为扩增条件直接影响扩增的 16SrRNA 序列。 5 2 实验部分 2.1 实验材料、药品和器材 2.1.1 实验材料 产黑色素细菌，刚刚筛选出的，大肠杆菌，来自实验室 2.1.2 实验药品 表 2-1 实验药品 序号 名称 产地 1 蛋白胨 浙江海川 2 酵母 膏 上海西王 3 琼脂 上海 4 Nacl 宁波 6 乙醇 宁波 7 NaOH 萧山 2.1.3 实验仪器 表 2-2 主要仪器 名称 型号 品牌或产地 恒温摇床 QYC-211 上海 电子天平 FA-1004 上海 蒸汽灭菌锅 SA-300VA 上海 凝胶成像系统 LG2020 杭州 电泳仪 北京 电泳槽 JY-SP-E 上海 冰箱 BCD-190GB 韩国三星 洁净工作台 宏瑞 苏州 台式高速冷冻离心机 H2050R 长沙 Eppendorf PCR 扩增仪 Mastercycler gradient 德 国 电热恒温水浴锅 KD-S24 上海 电热恒温培养箱 HG303 南京 BIDHIT 微量取液器 BIDHIT 上海
