1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 天然色素应用开发初步研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 :灵菌红素 具有免疫抑制、抗细菌、抗真菌、和抗疟疾等多种生物活性。 其作为一种天然抑菌剂，在纺织业，畜牧业也有较好的发展 前景。 本研究主要测试了灵菌红素对铜绿假单胞菌和黑曲霉的抑菌性，确定其最小抑菌浓度 及杀菌浓度，并定性的测定灵菌红素腈纶织物对大肠杆菌及金黄色葡萄菌的抑菌圈。实验结果表明，灵菌红素对铜绿假单胞菌具有抑菌效果，而对霉菌几乎没有抑菌效果，灵菌红素腈纶织物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌具有较明显的抑菌效果。 关键词 : 灵菌
2、红素；最小抑菌浓度；最小杀菌浓度 II Abstract: Prodigiosin has the advantages of immunosuppressive, anti-bacterial, anti-fungal and anti-malaria. As a natural antimicrobial agent, prodigiosin possesses good prospects for development in the textile industry, animal husbandry. The study tested the antimicrobial activi
3、ty of prodigiosin on Pseudomonas aeruginosa and Aspergillus niger, to determined the minimum inhibitory concentrations and bactericidal concentration, and analysed qualitatively the inhibitory zone of texture dyed by prodigiosin on E. coli and Staphylococcus aureus. The results showed that prodigios
4、in had a antibacterial effect on Pseudomonas aeruginosa, however it hadnt obviously inhibitory effect on Aspergillus niger, and the inhibitory effect of texture dyed by prodigiosin on E. coli and Staphylococcus aureus is prominent. Keywords: Prodigiosin; MIC； MBC III 目 录 摘要 错误 !未定义书签。 Abstract 错误 !未
5、定义书签。 1 绪论 错误 !未定义书签。 1.1 灵菌红素简介 错误 !未定义书签。 1.2 灵菌红素的生物活性 错误 !未定义书签。 1.2.1 抗肿瘤作用 错误 !未定义书签。 1.2.2 除藻活性 错误 !未定义书签。 1.2.3 抗菌作用 2 1.2.4 抗原生动物活性 2 1.3 灵菌红素应用最新进展 3 1.4 问题的提出及研究内容 3 2 实验部分 错误 !未定义书签。 2.1 实验器材 错误 !未定义书签。 2.1.1 菌种 错误 !未定义书签。 2.1.2 实验仪器和药品 错误 !未定义书签。 2.2 分析方法 5 2.3 实验内容 错误 !未定义书签。 2.3.1 灵菌红
6、素提取 错误 !未定义书签。 2.3.2 腈纶染色工艺 错误 !未定义书签。 2.3.2.1 染料的制备 7 2.3.2.2 染色工艺 7 2.3.3 抑菌实验准备 7 2.3.4 指示菌菌悬液的制备 7 2.3.5 抑菌圈的测定 7 2.3.6 最小抑菌浓度的测定 8 2.3.7 最小杀菌浓度的测定 8 3 结果与分析 9 3.1 灵菌红素腈纶织物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌试验 9 IV 3.2 红色素对黑曲霉抑菌圈测定 错误 !未定义书签。 3.3 灵菌红素对铜绿假单胞菌最小抑菌浓度测定 错误 !未定义书签。 3.3.1 铜绿假单胞菌最小抑菌浓度（ MIC）的测定 11 3.3.2 灵
7、菌红素对铜绿假单胞菌最小杀菌浓度 (MBC)测定 错误 !未定义书签。 4 结论 错误 !未定义书签。 参考文献 错误 !未定义书签。 致 谢 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 1.1 灵菌红素简介 灵菌红素 (prodigiosins)又 称 灵菌素、灵杆菌素，分子 式为 C20H25N30 (M=323.2)，具有三吡咯环骨架结 构 1-2 ，根据其 不同的 侧链基链基团，灵菌红素族还包括 Prodigiosin25-C ，metacycloProdigiosin Prodigiosen Cycleprodigiosin， desmethoxyprodigiosin和 Uncedylpr
8、odigiosin等一系列结构和性质相似的物质。 灵菌红素是由沙雷氏菌、放线菌等细菌产的次级代谢产物 ，具有免疫抑制、抗细菌、抗真菌、和抗疟疾等多种生物活性。 灵菌红素呈暗红色，具有绿色反光，熔点 为 151 152 。在碱性或中性溶液中呈橙黄色，酸性溶液中呈红色 。在甲醇溶液中， 酸性条件下在 540 am处有特征吸收，碱性条件下在 466 nm处有特征吸收， 灵菌红素 属于脂溶性色素，易溶于甲醇，丙酮，氯仿和苯，不溶于水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶， 灵菌红素 对温度稳定，但受 pH的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则
9、损失较大； A13+， Ca2+，K+， Ba2+等金属离子对 PG的稳定性影响不大， Zn2+有使 灵菌红素 增色的作用， Mg2+和 Mn2+对 PG有一定的破坏作用， Pb2+可以络合 灵菌红素 ，使之成为沉淀，白光和蓝光使 灵菌红素 发生光解，在红光和远红光下 灵菌红素 则不会降解。 1.2 灵菌红素的生物活性 1.2.1 抗肿瘤作用 Montaner 等 3的 研究 成果 表明， 灵菌红素 具有 诱 使 人结肠腺癌细胞株 DLD-1和 SW-620以 及人胃癌细胞株 HGT-1凋亡 的功能 ， 特别是 对转移性肿瘤细胞株 SW-620更具明显效果 ，其诱导结肠癌细胞凋亡呈 现 剂量依
10、赖性，主要表现为细胞收缩、肌动蛋白微丝结构重组等。 有人对于海洋羽毛山海绵 Mycaleplumose的 放线菌糖多孢菌 Saccharopolyspora sp (SP2 10)产生的十一烷基灵菌红素十一烷基灵菌红素 Metacycloprodigiosin（ MP）抗肿瘤活性及其作用机制进行了研究。 他们 先采用 MTT法观察 检测 了 MP对小鼠白血病细胞株 P388、人肝癌细胞株 BEL 7402细胞生长的影响；采用流式细胞术， 测试 了 MP对 P388、 BEL 细胞周期变化的影响；采用 Westem Blot法 分析了 PARP的裂解情况， 从而 判断 MP诱导 了 两个细胞系凋
11、亡活性。研究表明， MP具有 明显抑制 P388、 BEL 7402肿瘤细 胞生长 的功能 ， 其 将细胞阻断于 G2 M期 ，从而 诱导凋亡； MP导致细胞生长抑制的重要机制 是其 诱导活性氧，并与其诱导的 P38、 JNK活化密切相关，而与 ERKl 2活化无关；并且初步发现 MP还能够抑制肿瘤转移的多个环节，可能对肿瘤转移具有抑制作用4。 2 也 有人通过 MTT 法研究了灵菌红素对人胰腺癌细胞 8898的增殖抑制作用和部分作用机理 , 实验结果显示 ,加入灵菌红素后的细胞表现出了 明显的 凋亡细胞特异性，对于恶性肿瘤细胞 ,灵菌红素在 24h 培养 , IC50值约为 20 25gml
12、 - 1时 即 表现出相当强的杀伤力。 灵菌红素 同时也影响了 肿瘤细胞形态学。实验 结果暗示灵菌红素 可能 能够 诱导肿瘤细胞凋亡及增殖靶向性抗肿瘤细胞的作用。因此灵菌红素作为一种 汲取潜力 的抗癌新药 ,在这方面具有很大的 研究价值 5,6。 1.2.2 除藻活性 灵菌红素 (prodigiosin)是由多种放线菌 (Streptomyces)和细菌 (Serratia, Pseudomonas)产生的一类次级代谢产物 。最近 日本科学家 也 在海边筛选到一株能生产灵菌红素类似物 PG-L-1 的海洋细菌MS-02-063,通过实验发现 ,该灵菌红素类似物对 H. akashiwo 、 H
13、.circularisquama、 C. polykrikoides、Gyrodiniumimpudicum 和 Alexandrium tamarense 具有一定的除藻活性。 同时 韩国科学家在海边土壤里筛选到一株能 够产生 灵菌红素的海洋细菌 ,并将其命名为 Hahella chejuensis KCTC2396,研究发现， 该细菌产生的 拥有 抗生素 活性的灵菌红素 具有强烈的细胞溶解酶活性 ,对海洋赤潮藻 C. polykrikoides 具有较好的除藻活性 7. 1.2.3 抗菌作用 沙雷氏菌株 B2是一种 能产生红色素 的 对抗性细菌， 在植物中注入该细菌一小时后在接入病原体 ，
14、能 有效 阻止由 Rhizoctonia solani AG-1 IA.引起的大米外层覆盖物凋零（ Rice sheath blight）的疾病发生， 大量 实验 表明 从稻米植物和根围中分离得到的细菌在野外条件下可以调停生物控制作用剂产生的抗生素产品 8。 实验条件下， 由沙雷氏菌产生的天然红色素在植物疾病 的 生物控制方面 具有一定影响 。但他在农业条件下不稳定，另外，多种环境因素都会削弱 它的 作用。 Nobutaka Someya等 9研究了附生植物 的 微生物 所 产 灵菌红素在生物控制过程中的作用的稳定性。实验结果显示，固有附生植物微生物可能可以通过削弱药物抗生素的能力从而妨碍植物
15、病原体与生物控制药物的相互作用。 通过微生物进行生物控制 从而防止植物生病是相比于 化学杀虫剂更有前景的选择，沙雷氏菌能 够 有效控制樱草属植物和稻米中真菌类疾病，通过产生多种壳多糖和抗生素灵菌红素从而诱导植物系统 产生 抵抗力。 Tsukuba等 10将 从沙雷氏菌中提取疾病抑制基因导入启动子控制的稻米细胞，发现这些基因修饰过的微生物能不受生物及非生物因素影响而有效抑制由 Pyricularia oryzae引起的稻米爆发性疾病。 1.2.4 抗原生动物活性 经研究表明， 灵菌红素 也具有抗原声动物活性。 它 能保护海洋细菌免遭太阳辐射损害或 3 原生动物侵蚀，具有抗 Dinoflagell
16、ates 的活性 11。 1.3 灵菌红素应用最新进展 随着畜牧业规模化、商业化的发展，开发高效、无残留、无公害的安全饲料添加剂是社会发展的要求和必然结果。灵菌红素作为无公害天然抗生素，抗病原（微生物或寄生虫）活性强，不干扰肠道正常菌群的微生态平衡，促进畜禽增重以及提高饲料转化率效果显著； 化学性质稳定，不残留或极少残留于畜 产品中；细菌或寄生虫不易对其产生耐药性，与其他抗生素不产生交叉耐药性；毒性低，安全范围大，对人畜无害，且有抗癌、抗突变突变等作用 12,13，作为一种新型的饲料添加剂，具有广阔的发展前景。 随着人们生活水平的提高，人们对安全，健康，绿色的产品需求日益扩大，为了满足社会需求
17、，特别是内衣，汗衫，袜子等生产能够抗菌的纺织物是将来发展的一大趋势 14， 灵菌红素是一种天然色素，可以作为纺织工业中的染料，具无毒无公害，具抗菌性能，符合社会需求的纺织品用天然抗菌剂的要求。具有稳定性好，安全性高，抑菌能力强，生产方便等 优点，目前正在开发应用当中 15。 灵菌红素兼有营养保健，抗癌抗菌和天然红色素等多重功能，应用于医疗食品纺织工业都具有独特优势。综之，作为天然红色素， PG具多种独特的药理生理活性，其必将在医药、食品、环保等领域发挥重要作用。 1.4 问题的提出及研究内容 灵菌红素作为一种由微生物产生的天然色素，兼具有多种优越的生物活性作用，目前已受到人们的关注。但主要研究
18、还是集中在抗肿瘤和其生产制备工艺改进方面。 在全球绿色环保浪潮的影响下，天然植物染色又重新回到人们的视野。天然染料具有生态平衡特点 ： 色泽自然鲜艳 、 安全性高、无毒 且 有一定的营养价值和药理保健作用 、作为 生物可再生资源 ，生产过程对环境友好，无三废处理问题，所以重新引起染料界关注。目前印度、意大利和德国等国家的一些染料公司都在开发生产天然植物染料，但植物染料 的获取存在突出问题，由于 染料植物中色素含量较少，想要获得足够的染料，就必须大量地采摘和砍伐植物，造成对生态环境的破坏，违背了利用植物染料从而达到环保的初衷。 而灵菌红素作为一种天然色素，又具有良好的抑菌性能，因而在天然染料的研
19、究，特别是具有抗菌能力的天然染料的研究方面具有特别意义。 另一方面，灵菌红素作为一 种微生物产的无公害天然抗生素，有利于大规模生产，抗病原（微生物或寄生虫）活性强，且有抗癌、抗突变等作用，与传统的抗生素比较具有一定的优势，因此，其作为抗生素应用于饲料添加剂方面具有很大的研究价值。虽然灵菌红素在作为天然染料及饲料添加剂等方面的研究还很4 少，还有待于深入研究，但其研究价值已经引起了关注。 本课题主要对其在细菌真菌的抑菌能力方面进行了初步的研究，从而为在这方面的研究提供一定的依据，并定性测定染有灵菌红素的织物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力。 5 2 实验部分 2.1 实验器材 2.1.1 菌
20、种 金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌，黑曲霉，均由实验室保藏。 2.1.2 实验仪器和药品 表 2-1 实验仪器 编号 名称 型号 品牌或产地 1 恒温摇床 QYC-211 太仓 2 电子天平 FA-1004 上海 3 蒸汽灭菌锅 DSX-280 上海宜川 4 冰箱 BCD-190GB 韩国三星 5 洁净工作台 VS-1300 宏瑞 6 电热恒温培养箱 1 WMK-02 南京 7 电热恒温培养箱 2 HG303 南京 8 微量 取液器 BIDHIT 上海 9 电热锅 CL-80 嘉兴 表 2-2 实验药品 序号 名称 产地 1 蛋白胨 浙江海川 2 酵母 膏 上海西王 3 琼脂 上海 4 Nacl 宁波 6 葡萄糖 上海 7 土豆 嘉兴 8 乙醇 宁波 9 二甲基亚砜 上海 2.2 分析方法 利用 铜绿假单胞菌，黑曲霉作为指示菌，采取倍数稀释法确定其最小抑菌浓度 MIC，转接高于未长菌浓度培养基中的液体于新培养基中以确定其最小杀菌浓度 MBC， 实验结果长菌表示为 +，
